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【关键词】 杜仲降压片;TLC;HPLC;质量标准
Abstract Objective:To establish quality control standards for Duzhong Jiangya tablet.Methods:Herba Leonuri and Ramulus Uncariae Cum Uncis in preparation were identified by TLC,the content of paeoniflorin was determined by HPLC.Results:The chromatographic spots of samples showed the same colors with those of control article.The calibration curve showed a good linear relationship in the range of 0.25 μg~2 μg for baicalin,r=0.999 9.Conclusion:Two methods are accurate,reliable with good feasibility and repeatability,can be used to control the quality of this preparation effectively.
Key words Duzhong Jiangya tablet,TLC,HPLC,quality control standards 杜仲降压片由杜仲、益母草、夏枯草、黄芩、钩藤5味中药组成,具有补肾、平肝、清热之功效,用于肾虚肝旺之高血压症。本实验对该制剂中的益母草、钩藤进行了薄层鉴别,并采用HPLC法测定该制剂中黄芩苷的含量,现将结果报道如下。
1 实验材料
1.1 药品与试剂
实验用药材购自医药公司,经检验符合药典规定;杜仲降压片由贵州百花医药集团有限公司生产,批号060516;钩藤对照药材(121190-200402)、盐酸水苏碱(110712-200306)、黄芩苷(110715-200212)对照品由中国药品生物制品检定所提供。实验所用试剂除另有规定外,均为分析纯,色谱用试剂乙腈为色谱纯,水为重蒸水。
1.2 实验仪器
日立-2130高压恒流输液泵、日立-2400紫外可变波长检测器由日立分析仪器有限公司生产,N2000色谱数据处理工作站由浙江大学智达信息工程有限公司生产。
2 方法与结果
2.1 益母草薄层色谱鉴别
益母草中含有盐酸水苏碱,参照《中国药典》2005年版一部 [1]益母草膏项下薄层鉴别方法:取本品40片,去包衣,研细,称取10 g,加水20 mL,搅拌,加稀盐酸调节pH值为1~2,离心,取上清液加在强酸性阳离子交换树脂柱上,以水洗至流出液近无色,弃去水液,再以2 mol/L 氨溶液40 mL洗脱,收集洗脱液,水浴蒸干,残渣加甲醇1 mL使溶解,作为供试品溶液。按处方比例及制法制备缺益母草的阴性对照品,按供试品溶液的制备方法同法制成阴性对照溶液。另取盐酸水苏碱对照品适量,加甲醇制成1 mg/mL的溶液,作为对照品溶液。按照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法,吸取上述溶液各10 μL,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上,以正丁醇-盐酸-醋酸乙脂(8∶3∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以稀碘化铋钾试剂。结果供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,阴性对照色谱在相应位置上无斑点,即阴性无干扰。结果见图1。
2.2 钩藤薄层色谱鉴别
钩藤主要成分为生物碱,我们根据生物碱的性质,参照文献[3]的方法来制备样品溶液和阴性对照溶液,与钩藤对照药材对照。参照文献[4]方法进行展开和显色。取本品20片,去包衣,研细,称取6 g,加80%乙醇100 mL,置水浴上加热回流30 min,滤过;残留物加1%盐酸5 mL使溶解,滤过,滤液用氨水调pH至9,用氯仿萃取2次,每次10 mL,氯仿液浓缩至干,加0.5 mL乙醇溶解作为供试品溶液。按处方比例及制法制备缺钩藤的阴性样品,按供试品溶液的制备方法同法制成阴性对照溶液。另取钩藤对照药材2 g,同法制成对照药材溶液。参照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法,吸取上述3种溶液各10 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以氯仿-甲醇-氨水(20∶1∶1)下层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以稀碘化铋钾试剂。结果供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同的两个橙红色斑点,阴性对照色谱在相应的位置上无斑点。结果见图2。 2.3 黄芩苷的含量测定 [5]
2.3.1 色谱分析条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇-水-磷酸(45∶55∶0.2)为流动相,流速1.0 mL/min,检测波长为315 nm。理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于2 000。
2.3.2 供试品溶液的制备与测定 取本品10片,去包衣,研碎,混匀,取约0.25 g,精密称定,置于50 mL具塞锥形瓶中,精密加入70%乙醇30 mL,密闭,超声处理30 min,摇匀,滤过,滤液置50 mL容量瓶中,药渣及滤器用70%乙醇适量洗涤,洗液并入同一容量瓶中,加70%乙醇稀释至刻度,摇匀,滤过,即得。HPLC测定结果见图3。
2.3.3 对照品溶液的制备与测定 精密称取减压干燥4 h的黄芩苷对照品10 mg,置100 mL容量瓶中,加甲醇使溶解,并稀释至刻度,摇匀,即得(每毫升含黄芩苷0.1 mg)。HPLC测定结果见图4。
2.3.4 阴性对照溶液制备与测定 按处方比例及制法制备缺黄芩的阴性对照品,按供试品溶液的制备方法同法制成阴性对照溶液。经进样检测阴性对照图谱中在与黄芩苷峰相同保留时间处未见干扰。结果见图5。
2.3.5 标准曲线的制备 精密称取黄芩苷对照品,制成浓度为0.1 mg/mL的样品,分别进样2.5 μL、5.0 μL、10 μL、15 μL、20 μL测定峰面积,以峰面积积分值为纵坐标,黄芩苷进样量为横坐标绘制标准曲线,得回归方程Y=185 755X+23 136,r=0.999 9。表明黄芩苷在0.25 μg~2 μg之间呈良好的线性关系。
2.3.6 精密度测定试验 取同一对照品溶液10 L,注入高效液相色谱仪,重复进样5次,测定黄芩苷峰面积,并计算相对标准偏差RSD为1.23%。
2.3.7 稳定性试验 取同一供试品溶液,每隔2 h进样一次,共进样5次,按上述色谱条件测定黄芩苷峰面积,并计算黄芩苷峰面积积分值的相对标准偏差RSD为0.8%(n=5),表明供试品溶液在8 h内基本稳定。
2.3.8 重现性实验 取同一批号(批号:060516)供试品,按供试品溶液制备方法制备5份供试液,分别测定黄芩苷峰面积,并计算黄芩苷含量和相对标准偏差。结果黄芩苷平均含量为5.78 mg/片,RSD为1.88%。
2.3.9 加样回收率试验 取同一批号已知含量供试品(批号:060516;黄芩苷含量5.78 mg/片)20片,去包衣,研碎,混匀,取0.125 g,精密称定,共取5份,均加入黄芩苷对照品2.4 mg,按照供试品溶液制备方法制备供试液,进样量10 μL,测定黄芩苷峰面积,计算黄芩苷含量,并计算加样回收率,结果见表1。
2.3.10 样品含量测定 分别吸取对照品溶液及供试品溶液各10 μL注入色谱仪,测得峰面积,以外标法计算黄芩苷含量。结果见表2。
3 讨 论
杜仲降压片的君药为杜仲,主含木脂素、环烯醚萜类及杜仲胶等成分,降压成分为松脂醇-二葡萄糖苷,但中国药品生物制品检定所未能提供相应对照品,故无法进行定量测定。黄芩为方中臣药,采用HPLC法测定制剂中黄芩苷含量,方法简单,重复性好,可以作为含量测定指标。
【参考文献】
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:化学工业出版社,2005.
[2]王宝琴.中成药质量标准与标准物质研究[M].北京:中国医药科技出版社,1994:209-211.
[3]陈黄保.七星茶中钩藤及防风的薄层色谱鉴别[J].广东药学,1994(4):21.
[4]张榕,张春兰,方平飞,等.天麻钩藤颗粒的薄层色谱研究[J].华西药学杂志,2001,16(5):384-386