HPLC法测定丹参脂溶性成分的含量|丹参的脂溶性成分

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【摘要】运用HPLC技术分析丹参脂溶性成分组成，并建立了四种丹参脂溶性成分的HPLC含量测定方法。采用Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(4.6×250mm, 5μm)，以乙腈-水-乙酸为流动相进行梯度洗脱，流速为1.0mL•min-1，检测波长为280nm。通过与对照品比较，建立HPLC分析方法同时测定隐丹参酮、二氢丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA四种脂溶性成分的含量，该方法的重复性RSD小于2.0%，平均回收率为98.3～101.6%。本文所建立的方法操作简便快速，分析结果准确可靠。

【关键词】丹参脂溶性成分 HPLC 质量控制

【Abstract】By using HPLC technology，this paper established a rapid and reliable HPLC method for simultaneous determination of main tanshinones of Salvia miltiorrhiza．Four tanshinones were identified by using an Agilent Zorbax SB-C18 column(4．6 mm×250 mm，5μm)．A gredient elution was performed by using methanol-water-acetate acid as the mobile phase．The flow rate was 1.0 mL•min-1 with the detection wavelength set at 280 nm．The RSD of the repeatability was less than 2.0%．The recovery rates of all the tanshinones varied in the range of 97.3-101.6% respectively. The method is rapid，easily operated，reliable and could be used for the quality control of Salvia miltiorrhiza．

【Key words】Salvia Miltiorrhiza tanshinone HPLC quality control

丹参系唇形科植物丹参Salvia Miltiorrhiza Bunge的干燥根及根茎，具有是目前临床上常用的活血化瘀中药之一，现代药理证明其具有抗氧化、抗纤维化、促进肝细胞再生及改善肝脏微循环等功效[1-3]。丹参脂溶性成分被认为是其具有药理活性的主要成分，主要含有隐丹参酮、二氢丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA[4]，中国药典仅以丹参酮IIA作为脂溶性成分检验指标对丹参进行质量控制，难以全面而准确的反映丹参药材的质量。本文采用HPLC技术，建立同时测定隐丹参酮、二氢丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA含量的方法，以期更好的控制丹参药材的品质。

1　仪器与试药

1.1仪器

Agilent 1100型HPLC仪(G1311A四元泵，G1322A脱气机，G1329A自动进样器，G1316A柱温箱，G1315BDAD检测器，Chemstation色谱工作站)。

1.2试药

丹参酮I、丹参酮IIA对照品购自中国生物药品检验所，二氢丹参酮、隐丹参酮对照品购自长沙上河生物科技有限公司。甲醇、乙腈为色谱纯(美国Merck公司)，丹参药材购自安徽亳州中药材市场。

1.3试液制备

1.3.1对照品贮备液:取对照品二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA适量，精密称定，加入甲醇制成对照品混合液，即得。

1.3.2供试品溶液的制备:取丹参5g，加入甲醇50mL，超声处理30min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，微孔滤膜滤过即得。

1.4色谱分析条件

色谱柱: Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(4.6×250mm, 5μm，Agilent公司)，流动相A为0.1%乙酸溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱：0-5min时65%B，10～30min时70%B，40 min时95%B，流速1.0mL/min，柱温35℃，检测波长280 nm，进样量20μL。

2　实验结果与讨论

2.1线性关系考察

逐级稀释对照品储备液1-100倍得到8个不同浓度的对照品溶液，按1.4项下的色谱条件进行分析，以峰面积为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标，绘制工作曲线，计算各对照品的回归方程，见表1。

表1 四种丹参脂溶性成分线性回归方程

2.2精密度试验

按1.3.2项下方法制备供试品溶液，按1.4项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积，计算精密度。二氢丹参酮RSD 0.88%，隐丹参酮RSD 0.42%，丹参酮I的RSD 0.26%，丹参酮IIA的RSD 0.28%。

2.3重复性试验

按1.3.2项下方法制备同一批供试品溶液5份，计算每克丹参药材中各成分含量。二氢丹参酮含量0.74mg•g-1，RSD 1.86%;隐丹参酮含量1.34 mg•g-1，RSD1.32%;丹参酮I含量3.23 mg•g-1，RSD1.03%;丹参酮IIA含量1.75mg•g-1，RSD0.89%。

2.4稳定性试验

按1.3.2项下方法制备供试品溶液，按1.4项下色谱条件连续7天内进样测定，每天连续进样3次，测定峰面积，计算二氢丹参酮RSD 1.42%，隐丹参酮RSD 0.95%，丹参酮I的RSD 0.93%，丹参酮IIA的RSD 0.77%，表明样品溶液至少在一周内稳定。

2.5加样回收试验

配制二氢丹参酮0.253mg•mL-1、隐丹参酮0.469 mgmL-1、丹参酮I 1.012mg•mL-1、丹参酮IIA 0.778 mgmL-1的对照品溶液10mL。分别精确量取0.8，1.0，1.2 mL的对照品溶液各3份于锥形瓶中，挥干，每份加入精密量取丹参药材粉末约2g，混合均匀，精密加入25mL甲醇，按1.3.2项下方法制得供试品。按1.4项下色谱条件进行HPLC分析，每个样品进样3次，计算平均加样回收率。各物质平均加样回收率分布在98.3%-101.6%之间，符合检测要求。

2.6样品测定结果

取丹参药材，粉碎过筛，按1.3.2项下方法分别制备供试品溶液各5批，按1.4项色谱条件分析，每个样品进样3次，计算1g丹参药材中二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA的含量分别为0.71mg•g-1、1.32mg•g-1、3.34mg•g-1、1.70mg•g-1。

3　讨论与结论

本研究对丹参脂溶性成分的提取方法做了比较分析，分别采用了回流法、渗漉法、冷浸法、超声法、超临界萃取法，结果显示超声法操作简便、提取效率高，因此最终采用该法作为脂溶性成分的提取方法。

本研究采用HPLC技术对丹参药材中脂溶性成分进行了鉴定和含量测定分析，研究结果表明，实验所确立的方法准确可靠、操作简单、快速，检测范围全面，有利于提高丹参药材的质量控制标准，维持原药材的质量稳定性和用药安全性，值得进一步推广。

参考文献

[1]曹芝君,邱德凯,沈敏,陈颖. 重组肝再生增强因子、苦参素和丹参对肝脏星形细胞株IG12的作用[J].上海第二医科大学学报，2002,22(6):501-504.

[2]邵泉,赵浩亮,苗青旺,等.肝硬变大鼠肝部分切除术后肝再生的实验研究[J].中国临床医学,2005,12(3):542-543.

[3]郑虎占，董泽宏，祭靖.中药现代研究与应用[M].北京:学苑出版,1997,10.