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【关键词】 疟原虫
［摘要］ 目的 构建恶性疟原虫主要裂殖子表面蛋白1C末端相对分子质量1.9万片段（MSP119）毕氏酵母真核表达克隆。方法 利用PCR技术扩增出MSP119，插入pPIC9载体中，鉴定正确的MSP119基因，插入毕氏酵母分泌型表达载体pPIC9k中，DNA测序鉴定序列的正确性，转化酵母细胞。结果 筛选出的阳性克隆为MSP119表达克隆。结论 用分子生物学方法重组构建的MSP119毕氏酵母真核表达克隆，为高效表达MSP119及其活性鉴定奠定了基础。
［关键词］ 基因，MSP119；基因扩增；疟原虫，恶性；毕氏酵母；真核表达；聚合酶链反应
［ABSTRACT］ObjectiveTo construct MSP119 gene eukaryotic expression clones in pichia pastoris.MethodsMSP119 genes were amplified by PCR technique from recombinant vector pPIC9/PFCP2 and inserted into cloning vector pPIC9. Recombinant expression vectors were constructed by ligation with pPIC9k vectors. The validity of these sequences were confirmed by automatic DNA sequencing. By using electroporation transformation, recombinant expression vectors containing MSP119 genes were transformed into pichia GSll5 cells. ResultsThe positive clones were identified with recombinant MSP119 gene clones.ConclusionThe construction of MSP119 gene expression clone with molecular biology is the basis of MSP119 expression in pichia pastoris.
［KEY WORDS］genes, MSP119; gene amplification; plasmodium falciparum; eukaryotic expression;pichia pastoris;polymerase chain reaction
随着分子生物学技术的发展，基因工程疫苗的研制已成为当今世界性热点课题。毕氏酵母表达系统既具有原核表达系统能高效表达外源蛋白的特点，又具有真核生物的翻译后加工功能，使表达的外源蛋白具有生物学活性［1］，所以构建酵母表达克隆意义重大。本文选择恶性疟原虫主要裂殖子表面蛋白1C末端相对分子质量19×103片段（MSP119）的编码序列为目的基因，与酵母表达载体pPIC9k进行重组构建，经酶切鉴定后获得MSP119的真核表达克隆。现报告如下。
1 材料与方法
1．1 材料及来源
大肠杆菌(Escherichia c01)DH5a，毕氏酵母(PichiaPastoris)GSll5组氨酸缺陷型表达菌株，pPIC9(8 023 bp,ColElori,AmpR)、pPIC9k(9 276 bp,ColElori,AmpR kanR)，均购自美国Invitrogen公司。质粒pBluescriptks+(2 960 bp，ColElori，Amp+)为实验室保存；pBKS／PFCP质粒为实验室保存。限制性内切酶购自BioLabs；T4 DNA连接酶，TaqDNA聚合酶购自MBI公司；DNA Marker购自Promega公司。
1．2 引物设计与合成
为便于目的蛋白纯化，在下游引物5′端加6个His基因，设计引物如下：上游引物P1：5′CCGCTCGAGAAAAGATTACAAATTTCTCAACATC3′；下游引物P2，5′CGGAATTCCTATTAATGATGATGATGATGATGATTAGAGGAAGAGCAGAAG3′。
1．3 MSP119片段的扩增及回收
取pBKS／PFCP2质粒模板DNA(0．5 g／L) 1 μL在50 μL反应体系中扩增，PCR混和液的组成：引物P1、P2各1 μL，4种dNTP混合物(每种10 mmol／L)1 μL，10×Buffer缓冲液5 μL，TaqDNA聚合酶1 U，灭菌双蒸水补至50 μL。充分混匀后，置PCR扩增仪中扩增，条件如下：94 ℃预变性5 min； 然后94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min， 1期张忠广，常志尚，赵恒梅，等恶性疟原虫MSP119毕氏酵母真核表达克隆的构建51共28个循环；最后再72 ℃延伸10 min。取PCR扩增产物5 μL进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。按照华顺公司DNA回收试剂盒说明书进行操作，自凝胶中回收MSP119片段。
1．4 pPIC9／MSP119重组质粒的构建
1．4．1 目的基因及载体的酶切 MSP119片段与pPIC9载体同时用限制性内切酶Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ进行酶切，酶切反应在50 μL反应体系中进行，并选用两种酶的切割效率都较高的缓冲液，50 μL反应体系包括：DNA 20 μL(含2 μg DNA)，EcoR Ⅰ 1 μL(10×106U／L)，Xho Ⅰ 1 μL(10×106U／L)，100×BSA 0．5 μL，10×Buffer 2．5 μL，ddH2O 22.5 μL。37 ℃酶切1．5～2．0 h，然后用热灭活法或加入琼脂糖上样缓冲液终止酶切反应，并按照华顺公司DNA回收试剂盒操作说明进行酶切片段的回收。
1．4．2 目的基因与载体的连接 连接反应体系中外源DNA片段与载体DNA的摩尔数之比尽可能控制在4∶1，反应总体积为20 μL，T4 DNA连接酶的用量为1 U，16 ℃连接过夜。
1．4．3 pPIC9／MSP119重组质粒的转化 使用常规氯化钙法制备感受态受体菌，取10 μL连接物与200 μL感受态细胞混匀置冰浴30 min，然后转入37 ℃ 5 min进行热刺激。并再置于冰浴1 min。加入LB培养液1 mL于37 ℃培养45 min，低速离心沉淀细菌，并用无菌涂布棒将转化菌涂于抗生素选择性培养液平板上。置于37 ℃温箱培养过夜。
1．4．4 pPIC9／MSP119重组质粒的鉴定 碱裂解法小量快速制备重组质粒DNA，酶切鉴定。
1．5 酵母转化重组质粒pPIC9k／MSP119构建
1．5．1 酶切与连接 将pPIC9k与pPIC9／MSP119重组质粒分别用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ酶切。酶切方法及酶切后DNA片段的回收同前，连接反应体系(pPIC9k载体1 μL，MSP119片段5 μL，T4 DNA连接酶的用量为1 U)，16 ℃连接过夜。
1．5．2 重组DNA的转化与初步鉴定 将重组质粒载体转化至DH5a大肠杆菌中，经氨苄西林和Xgal互补筛选阳性菌落，提取阳性菌落重组质粒DNA，Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切鉴定。
1．5．3 测序 将阳性克隆送上海基因公司进行核苷酸序列测定。
1．6 转化酵母细胞并筛选阳性转化子将10 μg用Bgl Ⅱ切开的pPIC9k／MSP119溶于10 μL ddH2O中，并与80 μL准备好的酵母细胞混匀，移入预冷的0．2 cm电极杯，置冰浴5 min；用BioRad公司Gene Pulser电穿孔仪进行电穿孔，在RDB平板上涂布250 μL转化细胞，30 ℃培养，直至出现阳性转化子菌落(转化子因具有His基因可以在RDB平板上生长)。
2 结 果
2．1 MSP119基因的扩增及鉴定以重组质粒pPIC9／PFCP2为模板，以P1、P2为引物进行PCR反应。结果显示，扩增产物为单一条带，其大小与实际长度相符(图1)。
2．2 pPIC9k／MSP119重组质粒的鉴定用Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ进行双酶切鉴定后，重组质粒均切出两条条带，一是pPIC9k载体条带，约为9 kb；另一条是MSP119基因条带，约为400 bp,与实际大小相符（图2）。
2．3 测序与转化结果
测序结果显示，酵母表达质粒pPIC9k／MSP119内插入片段MSP119完全正确，转化酵母细胞后，在平板上长出大量菌落。
3 讨 论
由于抗药性疟原虫虫株和抗杀虫剂蚊媒的出现及蔓延，传统的控制疟疾传播流行的方法受到严重挑战［2］。因此，研制一种能有效阻断疟疾传播流行的疟疾疫苗成为当前重要的生物学课题之一。在疟原虫生活史中，惟有红内期原虫对人体致病，所以发展红内期疫苗对降低疟疾的发病率及病死率具有重要意义。疟原虫MSP1是一种表达于裂殖子表面的蛋白，可能参与裂殖子的入侵。在裂殖子侵入未感染红细胞的过程中，该蛋白经过了一系列的蛋白水解，最终裂解为相对分子质量为19 000的羧基端片段，并被携带进入细胞内。在猴疟疾模型（恶性疟原虫和间日疟原虫）和小鼠疟疾模型（约氏疟原虫）中，以MSP119和MSP142免疫可分别诱导出对攻击感染的保护作用［3，4］。然而MSP119更加引人注目，因为该分子在不同株疟原虫中高度保守。基于上述几点，我们选用了MSP119抗原进行重组疫苗的研究。目前已有研究用大肠杆菌等作为宿主细胞表达疟原虫MSP119。由于大肠杆菌是原核生物，其细胞内的还原状态使表达蛋白形成二硫键的机会减少，糖基化修饰程度低，提纯时影响蛋白质的折叠或使蛋白质失活，且分泌能力差，因此影响了表达蛋白在疟疾疫苗研制中的应用。加之疟原虫是真核生物，多数疟原虫无性血液期表面蛋白抗原需糖基化、磷酸化和二硫键形成功能性表位，才具有激发宿主产生保护性免疫应答的功能［5］。另外，要开展MSP119疫苗有效性试验均需大量高质量MSP119重组蛋白，用哺乳动物细胞作为宿主细胞表达系统表达的蛋白被加工后，在分子构型、理化性质和生物学活性方面均接近天然蛋白质，因而成为疟疾基因疫苗研制的理想工具，但其费用高，技术设备复杂，产量低；而毕氏酵母这一新近发展起来的高表达系统产量高，表达产物可分泌在无蛋白培养液中，易于纯化及较少糖基化等，而成为目前甚为理想的表达系统［6,7］，非常适用于疫苗等基因工程产品的开发和研制。基于以上研究背景，本实验成功构建了适用于酵母表达系统的真核表达克隆。为了提高构建的可行性，首先将目的基因构建到较小的pPIC9质粒中，然后再构建到pPIC9k质粒中。用于转化合适酵母宿主细胞的酵母表达载体均为大肠杆菌和酵母菌的“穿梭质粒”，包括原核系统(即大肠杆菌)和酵母的一些组件。既包括氨苄西林抗性基因、复制起始点序列，又包括分泌切割信号，便于阳性克隆的筛选；同时又能使酵母细胞将外源蛋白分泌到培养液中，有利于外源蛋白纯化，得到高纯度的外源蛋白疫苗。另外，pPIC9k质粒具有卡那霉素抗性，便于利用G418筛选高拷贝菌株，所以，本研究所构建的毕氏酵母表达质粒pPlC9K／MSP119为在毕氏酵母系统中高效表达MSP119及下游的抗原活性实验奠定了基础。
［参考文献］
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