免疫学的研究进展_重金属免疫学快速检测技术研究进展

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摘要：重金属免疫学检测技术是一种新型检测技术，与传统检测方法相比具有灵敏、快速、携带方便、费用低的优点，可用于现场快速检测。概述近年来免疫学检测技术的最新研究进展，并对该类方法的发展趋势和在食品安全检测中的应用前景进行了展望。

关键词：重金属；免疫检测；酶联免疫吸附反应；胶体金免疫层析技术

Advances in rapid Immunoassay of heavy metal ions

LIU Yanmei1 ZHONG Hui1 XIANG Junjian*

(Guang dong Province Key Laboratory of Molecular Immunology and Antibody Engineering, Antibody Engineering center of Jinan University, Guangzhou, Guang dong 510632)

Abstract: Heavy metal immunoassays are new methods for detection of heavy metal ions. Compared to the traditional chemical methods, immunoassays are not only fast, cheap, simple, but also reasonably portable, highly sensitive and selective. It could be used for rapid detection site. The recent progress of immunoassay was introduced piefly. And the tendency of development in immunoassay and its prospect used in the food safety determination were also forward promoted.

Key words: Heavy metal; immunoassays; ELISA; CGEIA

随着全社会对食物安全和环境保护问题的关注不断提高，重金属污染已成为全球性的问题。环境污染方面所指的重金属主要指生物毒性显著的汞、镉、铅、铬以及类金属砷，还包括具有毒性的重金属铜、钴、镍、锡、钒等污染物。这类有毒物质通过经由食物链浓缩且在身体不断累积，主要以慢性中毒和远期效应显出毒性，存在巨大的潜在危害。据国家环保局不完全统计，全国每年因重金属污染的粮食达1.2×106万kg，造成的直接经济超过200亿元，受不同程度重金属污染的耕地约有2000万hm2，约占耕地总面积的1/5[1]。中国水体重金属污染问题也十分突出，江河湖库底质的污染率高达80.1%。重金属一旦污染环境，很难自然修复，且随食物链畜积和传递，对食品安全与群众的健康造成严重威胁 [2]。

因此，近年来重金属污染越来越受到到人们的重视，针对重金属常用的传统检测方法包括电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)、石墨炉原子吸收光谱法(GF-ASS)、火焰原子吸收法(FASS)以及紫外分光光度法(UV)等。这些方法测定速度快、干扰少、灵敏度高而且准确性高，是现行的国家重金属安全检测的主要检测方法。传统的检测方法准确可信度高，但往往需要大型设备仪器，需要专业人员操作，有一定的时间地点局限性，不适合用于快速、现场定量检测。在突发性环境污染事件检测和大范围取样实时监测时，需要建立一种灵敏、高效、快速、方便的检测方法。因此，基于单克隆抗体的制备与应用[3]的免疫学检测技术，为实现环境及食品样品中重金属的快速定量或半定量检测提供了一个有效途径。本文综合论述了近几年来重金属检测中的样品前处理及免疫学检测技术，并对今后的研究发展方向做出展望。

1 样品前处理

在实际样品中，重金属一般以化合物形式存在，不能直接进行检测，在检测前进行样品前处理除去干扰因素使重金属以离子态存在与液相检测环境中，完整地保留被测组分同时使待测组份得到有效浓缩，检测前选择合适的前处理方法非常重要。目前重金属残留检测中常用的样品前处理方法：湿式消解法、干灰化法、微波消解法、酸浸提法等。

1.1 湿式消解法

湿消化法是通过强酸在高温条件下破坏有机质使金属离子释放出来，该方法对大多数样品适用且回收率高，但需要耗费大量强酸并有大量有害气体释放对环境和人体损伤较大。常用的酸是硝酸、高氯酸等混酸消化。

1.2 干灰化法

将样品在高温下灼烧，使样品中含有的大量纤维素、蛋白质和油脂等有机物质分解挥发，仅留下矿物质灰分。本方法操作简单、污染小，但消化周期长、灰化温度比较高、部分元素因为蒸发而损失掉、坩埚等材料的吸附作用导致回收率低。

1.3 微波消解法

微波消解利用微波的穿透性和激活反应能力，在密封装置，使样品温度迅速升高，加入了一定量的酸溶液，达到使样品中有机物质分解的目的。Ghaedi等[4]通过微波消解法提取重金属后，采用经表面活性剂修饰的活性碳来对重金属进行富集来降低其分析方法的检测限。Amorim Filho等[5]采用硝酸、双氧水混合微波消解式样后进行石墨炉原子吸收光谱测定抗生素中的Cd2+和Pb2+含量。

1.4 浸提法

通常为酸提取法即采用盐酸或硝酸直接浸提所需组份，其直接进样技术具有操作简便、速度快、不污染环境、避免被测元素的挥发损失等优点。李支微等[6]采用稀 HCl、HNO3及H2SO4对样品进行浸提，探索蔬菜中重金属Cu2+、Pb2+、Cd2+的最适浸提条件。Wei Gao等[7]采用1M NH4Ac浸提土壤中的Cd2+并进行了免疫学分析测定。

2 重金属特异性抗体的制备　　

自Reardan等[8]第一次通过组建In3+-L-benzyl-EDTA-BSA复合物抗原重并制备出了In3+的特异性抗体以来，国内外研究人员通过重金属与螯合剂配位形成复合半抗原，再与载体蛋白耦联制备完全抗原，进行动物免疫制备出大量的高特异性单克隆抗体[9-12]，为免疫学检测技术的发展提供了基础。

3 重金属离子的免疫学检测方法

近年来，国内外诸多学者对重金属残留的快速检测技术进行了许多研究，产生了许多快速检测方法，其中主要有酶联免疫吸附反应、胶体金试纸法[13] 、生物化学传感器方法[14-16]、荧光分析法等，免疫学检测方法具有一些传统方法不具备的优点，如方便、简单、快速、易携而经济的特点，表明该方法可满足随时随地、大范围、多样品抽检安全检测需要。

3.1 酶联免疫吸附反应（ELISA）

酶联免疫吸附反应是将抗原抗体特异性免疫反应与酶催化作用相联结起来的一种检测技术，具有特异性强、灵敏度高、方便快捷、分析容量大、分析成本低、安全可靠等优点，一般不需贵重的仪器，对使用人员的专业技术水平要求不高，容易普及和推广。ELISA检测重金属的常用方法是间接竞争ELISA和直接竞争ELISA。

3.1.1 间接竞争ELISA

其原理是将待检重金属离子与螯合剂形成重金属-螯合剂复合物后与包被在固相载体上抗原竞争结合单克隆抗体相同表位，添加酶标二抗，经底物显色后，根据标准曲线判定样品中待检物的含量。Wei Gao等[7]用乙二酸四乙胺(EDTA)螯合重金属Cd2+并偶联卵清蛋白(OVA)做免疫原免疫Balb/c小鼠，获得特异性单克隆细胞株4F3B6D9A1。其所得腹水型抗体纯化后用于间接竞争ELISA(icELISA)其半抑制率和抑制区间分别为2.59 ng/mL和0.20-40 ng/mL，除与Mn2+有2.9%和Hg2+有1.6%交叉外，以其他金属离子交叉反应性均小于1%。在实际样品检测中其结果与石墨炉原子吸收光谱（GFAAS）测定值其平均相关系为0.9873。Yuzhen Wang等[17]人以高特异性Hg2+单克隆抗体为基础建立icELISA方法检测水样、牛奶、青菜中的重金属Hg2+含量，该icELISA检测范围是0.1-100 ng/mL，其IC50和最低检测限分别达到了1.12 ng/mL和0.08 ng/ mL。在实际样品检测时回收率为80.00%-113%，其检测结果具有很高的可信度。

3.1.2 直接竞争酶联免疫吸附反应

即为一步竞争免疫检测原理为样品中的重金属离子与螯合剂螯合后与定量的重金属离子-螯合剂-酶复合物混合后竞争结合已包被在固相载体上的抗体，底物显色后可与标准曲线对比得出重金属离子浓度。Blake等人[18]用辣根过氧化物酶（HRP）标记Cd2+-EDTA复合物采用直接竞争免疫检测法对环境水样中的Cd2+进行检测，其检测限可达0.3ug/ml，其他杂质离子Ca2+、Mg2+、Fe3+对检测结果无干扰。检测结果与原子吸收法的检测结果相吻合，添加标准品回收率达100.29±3.60%。之后Darwis[19]等采用直接竞争免疫检测法对人血清中Cd2+含量进行检测。将抗Cd2+-EDTA复合物的抗体直接包被在底板上，将从血样中分离的Cd2+与适量EDTA混合形成络合物与竞争物竞争结合固定于底板上的抗体表位，通过底物显色后分析重金属镉含量。其检测浓度范围达0.24～100ug/L，与人血中其它金属无交叉，与原子吸收检测的结果相关系数达0.984。

Blake Robert C [20-22]率领的研究小组采用对各类重金属离子敏感的单克隆抗体技术对重金属离子进行现场快速检测，发表了系列研究论文并开始将基因重组技术应用于重金属-螯合剂复合物单克隆抗体制备，在采用免疫学方法检测重金属离子领域处于领先水平。

3.2 胶体金免疫层析技术

3.2.1 胶体金快速免疫层析法(CGEIA)

其原理是将特异性抗体固定于硝酸纤维素膜某一区域,滴加样品在干燥的硝酸纤维素膜的一段，由于毛细作用，样品沿膜向前移动，当移动至固定有抗体区域时样品中的抗原与抗体特异性结合免疫胶体金可使该区域显色，用来进行免疫诊断。它可以快速定性或者半定量检测重金属离子[23],其操作简单、快速、特异性高，之前由于只能用于定性实验而阻碍了胶体金技术的发展，如今有相关文献报道胶体金免疫层析技术可用于定量重金属检测。Kaoru Abe等人[24] 发明的颜色扫描仪利用在Cd2+-EDTA络合物和抗Cd2+-EDTA抗体特异性反应形成的抗原抗体复合物浓度来检测Cd2+浓度其检测限≤0.01 mg/L。由于抗原-抗体复合物的反应是定量的，采用一系列浓度梯度的标准Cd2+-EDTA与抗Cd2+-EDTA抗体反应后通过使用一个颜色扫描仪器以确定显色程度，以此为标准进行了实际大米样品和土壤样品中镉含量胶体金免疫层析检测。

3.1.2 免疫荧光层析快速诊断技术

在胶体金快速免疫层析技术基础上发展形成的免疫荧光层析快速诊断技术是以荧光物质作为示踪标志物，应用于抗原抗体反应的一种型免疫标记技术。近年来该技术在医学、动植物检疫、食品安全监督等领域得到了日益广泛的应用。付强强等人[23]建立了一种检测信号强度与检测物浓度呈正相关的新型新型荧光淬灭免疫层析试纸条，并成功制备了可用于检测小分子重金属Cr3+的荧光淬灭免疫层析试纸条，为免疫学方法检测重金属和免疫层析试纸条的发展提供了一个新的方向。

3.3 免疫荧光偏振技术

荧光物质标记抗原抗体而进行相应的抗体或抗原测定或定位技术称为免疫荧光技术。荧光偏振理论是由Perrin于1926年首先提出，溶液中的荧光分子在受到偏振光激发时，如果在激发时分子保持静止，该分子将发出固定偏振平面的发射光（发射光仍保持偏振性），如果分子旋转或翻转那么发射光的偏振平面将不同于初始激发光的偏振平面。基于该原理[26], 由异硫氰酸荧光素(FITC)标记的taxol与抗taxol的单克隆抗体结合会使荧光偏振增强。固定抗原（FITC-taxol）和抗体（taxol-antibody)的情况下,加入待测的样品（含未标记的taxol），与标记的taxol竞争，会导致荧光偏振下降。并由P/P0可以给出taxol的标准曲线来确定待测样品taxol含量[27]。

3.4 荧光分析法

常用的能发射荧光的物质有有机荧光染料、量子点、稀土纳米材料等。当常温物质经某种波长的入射光照射后其价电子从基态跃迁至激发态而激发态不稳定价电子会很快衰变至基态并伴随着光子的辐射发出比入射光波长长的出射光被称之为荧光而一旦停止入射光照发光现象随之消失。荧光分析法基于重金属离子能对荧光物质产生荧光猝灭或荧光增强作用浓度越大产生的猝灭或增强作用越大。这一原理对重金属离子原理进行检测。HuiLin等[29]利用基于荧光共振能量转移基于CdSe和CdTe量子点对前列腺抗原（PSA），在最佳条件下PSA抗原的线性范围为2.8-10uL/1，相关性系数R =0.9992检测限为1.5×10-2ug/ml。与传统的分光光度法、原子吸收光谱法等相比荧光分析法灵敏度高检出限更低选择性强而且测定样品不需经过分离富集显色测定等步骤操作简单，但荧光物质只对几种特定的重金属离子有响应如Hg2+、Cu2+、Ag＋、Pb2+和Co2+离子对其他离子却不能进行检测。而且包括金属在内的许多物质本身不产生荧光要加入荧光物质才能达到荧光分析的目的，这些问题在一定程度上限制了荧光分析的发展。

3.4.1 量子点标记免疫检测技术

该技术以半导体纳米晶标记抗原或抗体通过量子点颜色改变测定靶标物质含量的新型标记检测技术。以量子点作为标记物，具有荧光稳定、激发光谱广、发射光谱窄等优点，使的以量子点作为标记物被广泛应用于免疫诊断与分析中。陈清爱等人[28]在量子点对金属离子有荧光效应特性的基础上，利用Cu2+对CdTe量子点荧光淬灭，建立Cu2+比色传感器可快速实现对Cu2+的检测。同样利用Ag+对CdTe量子点荧光淬灭特性，研发了一种荧光Ag+定量检测方法，荧光强度与Ag+浓度在2.0×10-51~0×10-6mol/L内具有良好的线性关系，其检测限为（3σ/k）为8.8×10-7mol/L，其相关系数为0.9987。刘猛等人[30]基于量子点与石墨烯研发新型生物传感器用于快速、准确、定量检测环境中的重金属离子，构建了基于无机发光材料CdT纳米棒和有机荧光染料—钙黄绿素蓝的超灵敏荧光比色探针,对铜离子的检出限达到0.13nM,灵敏度是传统量子点荧光探针的60倍。利用石墨烯材料独特的二维结构和优异的荧光猝灭能力,发展了基于石墨烯/CdTe量子点的新型荧光免疫传感器用于甲胎蛋白的高灵敏检测,检测限可以达到0.15ng/mL,远低于其它量子点荧光免疫传感器。石墨烯的引入将传统的基于能量共振转移机理构建的荧光免疫传感系统中，供体-受体的有效作用距离从100A提高到223A,为其它高效荧光免疫传感器的构建奠定了基础。

4 讨论

近年来免疫学检测技术蓬勃发展，抗重金属离子的高亲和力和高特异性抗体的制备为免疫检测提供了发展的基石，新技术手段和新标记技术的不断涌现更加突进免疫学检测技术的发展。它广泛应用于食品安全中重金属污染的检测，但检测样品多为水样、液体样，实际样品前处理到免疫学检测过程还未成熟存在着技术难点，食品中重金属快速免疫学检测还需要进一步研究与探索。但随着蛋白质工程，基因工程的快速发展，经过抗体改造[33]，修饰或基因重组后获得高特异性，高灵敏度和更稳定的单克隆抗体成为免疫学学检测技术发展的关键，为运用免疫学检测手段快速检测食品中的痕量重金属离子提供了发展空间。