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【摘要】 目的 建立梅花点舌丹中药材蟾酥中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量测定方法。方法 采用HPLC法,色谱柱为Hypersil ODS(250 nm×4.6 nm)；流动相：乙腈-水(43.5∶56.5)；柱温：室温；流速：1.0 mL/min；检测波长为296 nm；进样量20 μL。结果 华蟾酥毒基和脂蟾毒配基在5.31～63.75 μg/mL、6.00～72.00 μg/mL范围内与峰面积积分值呈现良好线性关系,相关系数r分别为0.999 8和0.999 7,平均回收率分别为99.45%、99.39%,RSD分别为1.32%、0.55%(n=6)。结论 该方法准确、重复性好,可有效控制该产品的质量。
【关键词】 梅花点舌丹；华蟾酥毒基；脂蟾毒配基；高效液相色谱法
HPLC Determination of Paeoniflorin in Huachanshuduji and Zhichadupeiji of Meihuadianshe Dan SU Fu-li Shanxi Medical College for Continuing Education, Taiyuan 030012, China Abstract Objective To establish HPLC method for determination of Huachanshuduji and Zhichadupeiji in the Chinese drug Chansu of Meihuadianshedan. Method HPLC system includes ODS column, 4.6mm×250 mm, The mobile phase was acetonitrile-water (43.5∶56.5). The flow rate was 1.0mL/min. The detection wavelength was 296nm. The amount of injection was 20 μL Results the calibration curves of Huachanshuduji and Zhichadupeiji were linear in the range of 5.31～63.75 μg/mL、6.00～72.00 μg/mL (r=0.999 8、0.999 7). The average recoveries (n=6) concentration added in samples were 99.45%、99.39%. The deviation was 1.32%、0.55%. Conclusion The method is rapid, accurate and reliable. Key words：Meihuadianshe Dan；Huachanshuduji；Zhichadupeiji；HPLC 梅花点舌丹是由牛黄、麝香、雄黄、蟾酥、朱砂等21味药材组成的成药方剂,具有清热解毒、消肿止痛的作用。用于疮疡初起、无名肿毒、疔疮发背、乳痈肿痛。该成药原属地方标准,只收载了薄层色谱鉴别,无含量测定指标。该成药中含有药材蟾酥,2005版《中国药典》(一部)是以华蟾酥毒基、脂蟾毒配基为含量测定指标。为此,我们选择蟾酥中华蟾酥毒基、脂蟾毒配基作为本药含量测定指标,并对测定方法进行了研究。
1 仪器与试药
日立L-2130高效液相色谱仪；日立L-2420紫外检测器；大连依利特Echrom型色谱工作站；岛津2401紫外分光光度计；超声波清洗器SK252H型(上海产)；分析天平(上海良平精密仪器有限公司,Max100 g,D=0.000 1 g)。 华蟾酥毒基(批号110803-200504)和脂蟾毒配基(批号110718-200507)对照品购自中国药品生物制品检定所,供含量测定用。乙腈、甲醇(天津四友)为色谱纯,其他试剂均为分析纯。水为重蒸水。
2 溶液的配制
2.1 供试品溶液的配制 取重量差异项下的本品,研细,约1.5 g,精密称定,置锥形瓶中,精密加入甲醇25 mL,称定重量,超声处理(功率250 W,频率59 kHz)30 min,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,即得。
2.2 阴性样品溶液的制备
取缺蟾酥阴性样品,按“2.1”项下方法操作,即得。
2.3 对照品溶液的制备
取华蟾酥毒基对照品15.94 mg,精密称定,取脂蟾毒配基对照品18 mg,精密称定,分别置25 mL量瓶中,用甲醇溶解(必要时超声)并稀释至刻度,摇匀,分别精密量取各1 mL,分别置10 mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,即得对照品溶液(每1 mL含华蟾酥毒基63.75 μg、脂蟾毒配基72.00 μg)。
3 色谱条件
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂：乙腈-水(43.5∶56.5)为流动相；柱温：室温；流速：1.0 mL/min；检测波长为296 nm；进样量：20 μL。理论板数按华蟾酥毒基、脂蟾毒配基峰计算不低于2 700。色谱图见图1。
4 方法学验证
4.1 线性关系
取华蟾酥毒基和脂蟾毒配基对照品,精密称定,用甲醇稀释制成华蟾酥毒基为5.31、10.63、21.25、42.50、63.75 μg/mL和脂蟾毒配基为6.00、12.00、24.00、48.00、72.00 μg/mL的系列。取上述溶液20 μL,注入液相色谱仪,测定。结果华蟾酥毒基线性方程为Y=21.57X+10.15,相关系数r=0.999 8；脂蟾毒配基线性方程为Y=18.79X-10.56,相关系数r=0.999 7。结果表明,华蟾酥毒基、脂蟾毒配基对照品分别在5.31～63.75 μg/mL、6.00～72.00 μg/mL范围内与峰面积积分值呈现良好线性关系。
4.2 专属性
取阴性样品溶液,注入液相色谱仪,测定。结果在与对照品主峰保留时间相同位置无色谱峰出现(见图1),证明此方法具有一定的专属性。
4.3 精密度试验
取同一供试品,分别按“2.1”项下方法制备供试品溶液。精密吸取20 μL,注入液相色谱仪,依法连续进样6次。结果华蟾酥毒基RSD=2.89%,脂蟾毒配基RSD=1.50%；表明精密度良好。
4.4 稳定性试验
取同一供试品溶液,在0、2、4、6、8、10、24 h不同时间内,分别精密吸取20 μL,注入液相色谱仪,进行测定。结果华蟾酥毒基RSD=2.89%,脂蟾毒配基RSD=2.40%；表明供试品溶液在24 h内基本稳定。
4.5 重复性试验
精密称取本品约1.5 g,共6份,分别按“2.1”项下方法制备供试品溶液,于上述色谱条件下连续测定,分别计算华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量(n=6),RSD分别为2.38%和2.96%。
4.6 回收率试验
精密称取同一供试品,共6份,分别精密加入华蟾酥毒基、脂蟾毒配基对照品,分别按“2.1”项下方法制备供试品溶液,于上述色谱条件下连续测定,计算各样品中华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的含量,并计算回收率。结果见表1。表1 华蟾酥毒基、脂蟾毒配基回收率实验结果 （略）
4.7 样品含量测定
取本品各批约1.5 g,精密称定,分别按“2.1”项下同法操作制备供试品溶液,于上述色谱条件下连续测定,计算各样品中华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的含量。结果见表2。表2 样品测定结果（略）
5 讨论
5.1 供试品溶液制备方法的选择
本品为中药复方制剂,组分复杂,经实验发现,样品的提取及前处理对华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量测定及各组分的分离影响较大,故对样品的提取及前处理条件进行了筛选。为确定用何种溶剂提取、溶剂的用量、超声处理的时间,我们参考2005年版《中国药典》(一部)梅花点舌丸、麝香保心丸及蟾酥药材等项下的含量测定方法[1],采用正交设计方法安排实验(见表3)。实验结果表明,提取液用甲醇,溶液剂量25 mL,超声处理30 min,可得到满意的结果。表3 三因素三水平正交试验（略）
5.2 吸收波长的选择
取上述对照品溶液适量,用紫外可见分光光度计于200～800 nm波长处扫描,结果在296 nm处有最大吸收,参考有关文献及蟾酥药材的质量标准,决定采用296 nm作为检测波长。
5.3 流动相的选择
我们参考2005年版《中国药典》(一部)蟾酥的质量标准,以及成药中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量测定方法[1],比较了不同流动相配比,最终选择了乙腈-水(43.5∶56.5)为流动相。在该色谱系统条件下,可使华蟾酥毒基和脂蟾毒配基与其他组分良好分离。方法学研究结果表明,在选定的色谱条件下,其他组分不干扰华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量测定,系统适用性、方法重复性、精密度良好,回收率符合要求,测定结果准确。
【参考文献】
[1] 国家药典委员会.中国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社,2005. 593,368.