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【摘要】 目的 测定陕西境内不同产地、不同生长期女贞子中齐墩果酸与熊果酸的含量。方法 采收陕西境内关中3市(渭南、西安、宝鸡)与陕南2市(安康、汉中)10月产女贞子；并采收西安8、9、10、11和12月产女贞子,去杂质阴干,室温密闭贮藏。采用HPLC法,Lichrospher C18(4.6 mm×250 mm,5 μm) 色谱柱,Waters600高效液相色谱仪,流动相为乙腈-甲醇-水-磷酸-三乙胺(50∶30∶20∶0.02∶0.04),流速1 mL/min。建立标准工作曲线,检测各地、各时间点样品中齐墩果酸和熊果酸含量。结果 安康产女贞子中齐墩果酸与熊果酸含量均达到同期最高。不同生长期女贞子在10月份出现齐墩果酸含量最高值；而熊果酸在幼果中(8月)含量最高并随生长期延长逐渐下降。到12月时二者含量均降至最低。结论 女贞子在不同产地、不同生长期齐墩果酸和熊果酸的含量是不同的,故在实际应用时应根据不同需要适时采收。
【关键词】 女贞子；陕西；齐墩果酸；熊果酸；高效液相色谱法
Abstract：Objective To determine oleanolic acid (OA) and ursolic acid (UA) from Fructus Ligustri Lucidi in diffrernt habitat and various growing stages. Method We picked the fruits of Fructus Ligustri Lucidi in Otober in five cities of Shanxi, and in August, September, October, November and December in Xi’an. Removed impurities and storaged the fruits under room temperature .By HPLC with Waters 600 as its chromatographic system, and Lichrospher C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm) column was applied with CH3CN-CH3OH-H2O-H3PO4-(C2H5)3N (50∶30∶20∶0.02∶0.04) as its mobile phase, the flow rate was 1 mL/min. The standard working curve was made to determine the contents of OA and UA at different habitat and different time spot from samples. Result The contents of OA and UA were highest in Ankang city. During prolonging growing stages, the highest contents of OA and UA were October and August, respectively. They both reduced to the lowest point in December. Conclusion The contents of OA and UA changed in different habitat and diffrernt growing stages of Fructus Ligustri Lucidi. It was suggested that we should mainly base on the highest contents to select the harvest time according to our demands. Key words：Fructus Ligustri Lucidi；Shanxi；habitat；growing stages；oleanolic acid；ursolic acid；HPLC 女贞子是木犀科植物女贞(Ligustrum lucidum Ait.)的果实,在我国药材资源丰富,具有滋补肝肾、明目乌发之功效[1]。女贞子中含有齐墩果酸、熊果酸、甘露醇、多糖及微量元素等多种成分,已见的报道中齐墩果酸与熊果酸是其发挥药理作用的主要有效成分。这两种成分的含量与女贞子的生长空间、时间的变化密切相关。本实验测定陕西境内不同地点、不同生长期女贞子中齐墩果酸和熊果酸的含量,对于指导该药的采收时间及合理应用具有实际意义。
1 临床资料
Waters600高效液相色谱,2996二极管阵列检测器,7725i手动定量进样阀,Empower软件。Agilent微量进样器。R200D电子分析天平(德国Sartorius公司)。250LH超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)。
流动相所用甲醇、乙腈均为色谱纯(美国Fisher公司),超纯水(美国Millipore纯水系统)；磷酸、三乙胺(AR,西安化学试剂厂)。齐墩果酸对照品(中国药品生物制品检验所,批号110709-200304)；熊果酸对照品(中国药品生物制品检验所,批号110742-200415)。女贞子药材采自陕西境内不同产地,经陕西省药品检验所鉴定该药材系木犀科植物女贞(Ligustrum lucidum Ait.)的果实。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱Lichrospher C18(4.6 mm×250 mm,5 μm,江苏汉邦公司)；流动相：乙腈-甲醇-水-磷酸-三乙胺(50∶30∶20∶0.02∶0.04)；流速：1 mL/min；检测波长：205 nm；柱温：室温；进样量：20 μL。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取齐墩果酸与熊果酸对照品12.68、5.12 mg,分别置25 mL容量瓶中,加甲醇制成每1 mL分别含0.507 2 mg齐墩果酸与0.204 8 mg熊果酸的混合溶液,摇匀,即得对照品贮备液,备用。
2.3 供试品溶液的制备
精密称取过65目筛的女贞子干燥粉末0.2 g,加甲醇50 mL,称重,超声处理30 min,取出,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,经0.45 μm微孔滤膜过滤,即得供试品溶液。
2.4 线性关系考察
精密吸取2.2项下对照品贮备液1、2、3、4、5 mL,分别置于10 mL容量瓶中,甲醇定容,摇匀,得5个不同浓度的混合对照品溶液。分别精密吸取20 μL,按上述色谱条件进样分析。以浓度X(μg/mL)为横坐标、峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线并计算回归方程。回归方程为：齐墩果酸Y=12 373.29X+108 249.93, r=0.999 6；熊果酸Y=12 098.02X+85 955.73,r=0.999 8。结果表明：齐墩果酸在50.72～253.6 μg、熊果酸在20.48～102.4 μg呈良好的线性关系。
2.5 精密度试验
精密吸取同一混合对照品溶液20 μL,按上述色谱条件,重复进样5次,测得齐墩果酸、熊果酸峰面积的RSD分别为1.3%、2.2%。
2.6 稳定性试验
取同一供试品,按供试品溶液的制备方法操作,分别于0、1、2、4、8 h精密吸取20 μL进样,测得齐墩果酸、熊果酸峰面积的RSD分别为1.7%、2.3%。结果表明,供试品溶液在8 h内稳定性较好。
2.7 重复性试验
精密称取同一样品10月样(№3)5份,按供试品溶液制备方法分别制备5份供试品溶液,测得齐墩果酸、熊果酸含量的RSD分别为0.64%、2.9%。
2.8 加样回收率试验
取已知含量的供试品5份,分别精密加入一定量齐墩果酸与熊果酸对照品,照供试品溶液的制备方法进行处理,按上述测定方法进行测定,计算回收率。结果见表1。表1 加样回收率试验结果(略)
2.9 样品含量测定
取不同产地、不同生长期的女贞子样品0.2 g,按2.3项下方法制成供试品溶液,在上述色谱条件下,每个样品重复测定5次,测量峰面积并用外标法计算样品中齐墩果酸与熊果酸的含量。对照品和样品的高效液相色谱图见图1,样品含量测定结果见表2、表3。表2 陕西境内不同产地女贞子中齐墩果酸和熊果酸的含量（略）表3 西安产不同生长期女贞子中齐墩果酸和熊果酸的含量（略）
3 讨论
3.1 空间环境对植物的影响(不同产地)
由表2可见,陕西地区在同一时期安康产女贞子中的齐墩果酸和熊果酸的含量最高,这与当地的气候环境(气温、日照、土壤)等因素有关。女贞子属常绿植物,适宜生长在温暖潮湿的环境,陕北最冷月1月平均气温为-10～-4 ℃,故女贞子不适宜在陕北生长。本次研究未涉及陕北地区。
3.2 时间变化对植物的影响(不同生长期)
通常认为女贞子在12月冬至前后果实紫黑色且饱满即为成熟,并大多在此时采收。由表3可见,不同生长期女贞子在10月份出现齐墩果酸含量最高值；而熊果酸在幼果中(8月)含量最高并随生长期延长逐渐下降。到12月时二者含量均降至最低。故中药材的采收应考虑其有效成分含量的动态变化,再结合其产率,以保证药物能发挥最大的疗效和节约资源。
3.3 流动相的选择
齐墩果酸和熊果酸为五环三萜类同分异构体,在中性流动相中三萜酸可解离,很难分离。参考文献[2-3]实验中曾采用的甲醇-水(90∶10)、乙腈-水(80∶20)、乙腈-水-磷酸(75∶25∶0.02)、甲醇-0.5%醋酸铵溶液(90∶10)、乙腈-0.5%冰醋酸(75∶25)、乙腈-甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(50∶30∶20∶0.02∶0.04)等多种流动相,分离效果均不理想。其中选择冰醋酸峰形较平,故选用磷酸。通过加入适量磷酸和三乙胺调节流动相pH值,可抑制齐墩果酸和熊果酸的解离,改善色谱峰的峰形,且pH值对齐墩果酸和熊果酸的分离有较大影响。经过反复实验,最终选择乙腈-甲醇-水-磷酸-三乙胺(50∶30∶20∶0.02∶0.04)作为流动相,在此条件下,所得图谱基线平稳,齐墩果酸和熊果酸达到了较好的分离。
【参考文献】
1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：化学工业出版社, 2005.31.
[2] 石心红,郭江宁,翟静华.HPLC法测定女贞子中齐墩果酸、熊果酸的含量[J].海峡药学,2005,17(4)：41.
[3] 李 涛,郝武常,徐长根,等.HPLC-ELSD法测定不同产地女贞子中齐墩果酸与熊果酸的含量[J].中药材,2005,28(5)：391.