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【摘要】 目的 对双根清脑颗粒的质量标准进行研究。方法 采用薄层色谱法鉴别薏苡仁、板蓝根、郁金；采用高效液相色谱法测定葛根素的含量。结果 薄层色谱分离效果较好,斑点清晰,阴性无干扰。葛根素的线性范围为5.184～40.50 μg/mL,平均加样回收率为99.93%,RSD=1.81%。结论 本方法可行,重复性好,能有效控制双根清脑颗粒的质量。
【关键词】 双根清脑颗粒；葛根素；质量标准；薄层色谱法；高效液相色谱法
Abstract：Objective To establish the quality control standard for Shuanggen Qingnao Granules. Methods TLC was used to identify Yiyiren SEMENCOICIS, Yujin RADIXCURCUMAE, Banlangen RADIX ISATIDIS；and HPLC was used to determine the content of Puerarin in Shuanggen Qingnao Granules. Results The TLC spots developed were fairly clear, and the bland test showed no interference. Puerarin showed a good linear relationship in the range of 5.184～40.50 μg/mL, the average recovery of Puerarin was 99.93%, and RSD was 1.81%. Conclusion The method is accurate and quick, and can be used for the quality control of Shuanggen Qingnao Granules. Key words：Shuanggen Qingnao ranules；quality standard；TLC；HPLC 双根清脑颗粒由葛根、板蓝根、郁金、薏苡仁等组成,具有补肾益髓养脑、益气活血、化瘀通络之功效。为控制该产品质量,本实验采用薄层色谱法对方中板蓝根、薏苡仁、郁金进行定性鉴别,采用高效液相色谱法对葛根素进行定量分析。
1 仪器与材料
硅胶G(薄层层析用,青岛海洋化工厂)；Agilent1100高效液相色谱系统。 葛根素(中国药品生物制品检定所提供,批号110752- 200209)；双根清脑颗粒(本实验室制备)。甲醇(色谱纯)；其他化学试剂均为分析纯。
2 定性鉴别
2.1 板蓝根的薄层色谱鉴别
取板蓝根对照药材、市售药材、样品、阴性对照粉末各1 g,加稀乙醇40 mL,超声处理20 min,滤过,滤液蒸干,残渣加稀乙醇2 mL使溶解,作为供试品溶液。照薄层色谱法[2005年《中国药典》(一部)附录ⅥB]试验,吸取上述对照药材10 μL、市售药材10 μL、样品15 μL、阴性溶液15 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上(自然干燥)。以正丁醇-冰醋酸-水(19∶5∶7)为展开剂,展开,取出,热风吹干,喷以茚三酮试液,105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,样品在与对照药材相应的位置上显相同颜色的斑点,阴性对照无干扰。
取板蓝根对照药材粉末2 g、样品4 g、阴性对照2 g,加氯仿40 mL,超声40 min,滤过,滤液蒸干,残渣加氯仿1 mL使溶解,作为供试品溶液。按薄层色谱法[2005年《中国药典》(一部)附录ⅥB]试验,吸取上述3种溶液,分别以对照药材、样品、阴性对照各10、15、20 μL点样,点于同一硅胶G薄层板上。以苯-氯仿-丙酮(5∶4∶1)为展开剂,展开,展距为8 cm,取出,晾干。供试品色谱中,在与对照药材相应的位置上显相同颜色的斑点,阴性对照无干扰。
2.2 薏苡仁的薄层色谱鉴别
取薏苡仁对照药材、药材、样品粉末、阴性对照粉末各1 g,以10倍量70%的乙醇超声40 min,滤过,滤液置80 ℃水浴蒸干,取样量为1 g,加石油醚(60～90 ℃)10 mL,超声处理30 min,滤过,滤液蒸干,残渣加石油醚(60～90 ℃)1 mL使溶解,作为供试品溶液。按薄层色谱法[2005年《中国药典》(一部)附录ⅥB]试验,吸取上述对照药材10 μL、药材10 μL、样品15 μL、阴性对照15 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚(60～90 ℃)-乙醚-乙酸(15∶1∶0.01)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸溶液,于105 ℃烘约5 min。供试品色谱中,在与对照药材、药材相应的位置上显相同颜色的斑点,阴性对照无干扰。
按薄层色谱法[2005年《中国药典》(一部)附录ⅥB]试验,吸取上述对照药材10 μL、药材10 μL、样品15 μL、阴性对照15 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上。以石油醚-乙醚-乙醇(15∶1∶0.05)为展开剂,展开,展距约为8 cm,取出,晾干,喷以10%的硫酸-乙醇液,于110 ℃烘15 min显色,于365 nm紫外光灯下检视。供试品色谱中,在与对照药材、药材相应的位置上显相同颜色的斑点,阴性对照无干扰。
2.3 郁金的薄层色谱鉴别
取对照药材、药材、样品粉末、阴性对照粗粉各2 g,以10倍量70%的乙醇超声40 min,滤过,滤液置80 ℃水浴蒸干,取样量为2 g,上述4种样品粉末分别加乙醇20 mL,超声提取30 min,滤过,滤液蒸干,残渣加乙醇2 mL使溶解,作为供试品溶液。按薄层色谱法[2005年《中国药典》(一部)附录ⅥB]试验,吸取上述对照药材10 μL、药材10 μL、样品15 μL、阴性对照15 μL 4种溶液,分别点于同一硅胶G薄层板上。以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(8∶1.5)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%的硫酸-乙醇液,于110 ℃烘15 min显色。供试品色谱中,制剂在与对照药材、药材相应的位置上显相同颜色的斑点,阴性对照无干扰。
按薄层色谱法[2005年《中国药典》(一部)附录ⅥB]试验, 吸取上述对照药材10 μL、药材10 μL、样品15 μL、阴性对照15 μL 4种溶液,分别点于同一硅胶G薄层板上。以己烷-乙酸乙酯(85∶15)为展开剂,展开,取出,以10%磷钼酸乙醇液喷雾后,于105 ℃烘约10 min。供试品色谱中,在与对照药材、药材相应的位置上显相同颜色的斑点,阴性对照无干扰。
3 葛根素的含量测定
3.1 色谱条件
色谱柱：Lichrospher C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)；流动相：甲醇-水(25∶75)；流速1.0 mL/min；检测波长：250 nm；柱温：30 ℃；理论塔板数按葛根素计应不低于2 000；进样量4 μL。
3.2 对照品溶液的制备
精密称取葛根素对照品4.05 mg,置10 mL量瓶中,用30%乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,精密移取2 mL,置10 mL量瓶中,加30%乙醇稀释至刻度,摇匀,即得81.0 μg/mL的对照品溶液。
3.3 供试品溶液的制备
取双根清脑颗粒,研细,取0.45 g,精密称定,加甲醇超声处理30 min,定容至25 mL,取上清液,经0.45 μm微孔滤膜过滤,即得。
3.4 空白试验
取缺葛根的阴性制剂,按供试品溶液制备方法制成葛根阴性对照溶液。将葛根素对照品溶液、供试品溶液和葛根阴性对照溶液,分别注入液相色谱仪中,进行测定,得到色谱扫描图(见图1),显示供试品与葛根素在相应位置有相似的峰,而阴性对照则无,说明其它药味不干扰葛根素的检测。
3.5 线性关系考察
取3.2项下的对照品溶液。分别精密吸取0.5、0.25、0.126、0.064 mL置1 mL容量瓶中,加30%乙醇至刻度,摇匀,进样测定。以对照品进样浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线,则回归方程为Y=13.124 93X-7.027 8,相关系数r=0.999 7。表明进样量在5.184～40.50 μg/mL范围内线性关系良好。
3.6 精密度试验
对同一葛根素对照品溶液按上述色谱条件连续测定5次,结果RSD为0.2%。试验表明本法精密度较好。
3.7 稳定性试验
对同一供试品溶液,在12 h内每隔一定时间测定1次,共测定5次,结果5次测定的平均含量为29.8 mg/g,RSD为0.7%。
3.8 重复性试验
对同一批样品,按上述色谱条件平行测定5份。5份测定结果的平均值为30.0 mg/g,RSD为1.5%。表明本法的重复性较好。
3.9 加样回收率测定
精密称取已知含量的双根清脑颗粒3份,每份约0.45 g,分别精密添加葛根素对照品适量,按3.3项下方法制备供试品溶液,进样测定,计算回收率。结果平均回收率为99.93%,RSD= 1.81%,符合定量分析的要求,见表1。表1 回收率测定结果（略）
3.10 样品测定
取3批样品,根据3.3项下方法制备供试品溶液,分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各4 μL,注入高效液相色谱仪,测定,结果见表2。表2 样品测定结果(略)
4 讨论
4.1 薏苡仁薄层鉴别的展开系统
曾采用石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-醋酸(10∶3∶0.1)为展开剂,置紫外光灯(365 nm)下检视,阴性与阳性在同一位置显色,有干扰。后改用石油醚(60～90 ℃)-乙醚-乙酸(15∶1∶0.01)为展开剂,斑点清晰,阴性无干扰。
4.2 板蓝根提取溶剂的选择
在薄层鉴别板蓝根中的靛玉红时,曾用乙醇超声提取,但提取效率较低,采用氯仿提取效果好,所得靛玉红含量较高,薄层斑点明显,阴性无干扰。