【复发及难治急性髓细胞白血病病人多药耐药基因检测及意义】髓细胞白血病

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【摘要】目的研究复发及难治急性髓细胞白血病（AML）病人多药耐药基因（mdr1）的表达及其与临床疗效的关系。方法采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）检测65例AML病人（其中初诊组38例，完全缓解组14例，复发难治组13例）、27例非白血病病人和健康人（包括健康人15例、缺铁性贫血病人10例、特发性血小板减少性紫癜病人2例）mdr1基因的表达水平，并分析其临床意义。结果 AML病人mdr1基因表达阳性率高于对照组，复发难治组mdr1基因表达阳性率高于初诊组和完全缓解组，临床耐药组mdr1基因表达阳性率显著高于非临床耐药组，CR率非临床耐药组显著高于临床耐药组，差异均有显著性(χ2=8.334～49.630，P<0.01)。结论 mdr1基因阳性表达与AML病人临床耐药密切相关，是影响预后的重要因素，可作为检测临床耐药和判断预后的指标之一。

【关键词】白血病髓样多药耐药相关蛋白质类抗药性肿瘤

［ABSTRACT］ObjectiveTo study the expression of multidrug resistance gene (MDRG) and the curative effect in relapse or refractory acute myelogenous leukemia (AML).MethodsA semiquantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR) was used to investigate the transcription levels of the human MDRG in 65 AML patients and 27 controls, and analyze the its clinical significance.ResultsMDRG expression was significantly higher in AML patients than in the controls, and higher in relapsed/refractory AML patients than in those newly diagnosed or in complete remission. The gene expression was significantly lower in nonresistant patients than in resistant ones. Complete remission (CR) rate of nonresistant patients was higher than resistant ones (χ2=8.324-49.630，P<0.01).ConclusionMDRG overexpression is significantly associated with clinical multidrug resistance and prognosis, and it is one of the indicators for predicting the prognosis of AML.

［KEY WORDS］leukemia, myeloid; multidrug resistanceassociated proteinsmdr1; drug resistance, neoplasm

国内外研究证明，多药耐药基因（mdr1）的存在及表达是产生多药耐药（MDR）的主要机制。本文应用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）技术检测了65例急性髓细胞白血病（AML）病人、27例非白血病病人和健康人的mdr1基因表达水平，分析mdr1基因表达水平与临床耐药的关系。

1 材料和方法

1.1 细胞系与细胞培养

K562/A02由中国医学科学院血液学研究所惠赠，用阿霉素（ADM）诱导K562细胞建立的多药耐药细胞株[1]，具有典型的MDR表型。K562/A02细胞在培养过程中加1 ng/L的阿霉素，使用前3 d撤药。

1.2 病人及分组

根据白血病诊断标准[2]，选择急性髓细胞白血病(AML)病人65例，男39例（年龄18～63岁），女26例（年龄22～59岁），中位年龄34.2岁。其中初诊组（AMLP）38例，完全缓解（CR）组(AMLC)14例，复发难治组(AMLR)13例；M0和M1各1 例，M219例，M315 例，M414 例，M59例，M62例，M71例，杂合型白血病（HAL）3例。对照组27例，其中男16例（年龄19～52岁），女11例（年龄15～46岁），中位年龄30.9岁，包括健康人15例、缺铁性贫血病人10例、特发性血小板减少性紫癜病人2例。15例健康人取外周血，余均取骨髓。病人为青岛大学医学院附属医院及聊城市人民医院住院病人。

临床耐药诊断标准：①对一线方案诱导治疗2个疗程无效；②第1次缓解后6个月内复发；③第1次缓解后6个月以上复发经诱导治疗无效；④2次或2次以上复发。

1.3 半定量RTPCR

细胞总RNA的提取：用TRIzol提取细胞总RNA。经MMLV逆转录酶合成cDNA，以逆转录产物加dNTPs、PCR Buffer、mdr1引物进行PCR，取PCR产物定量10 μL 扩增产物，25 g/L琼脂糖凝胶电泳，灌胶前加EB（1 mL 1×TAE 加1 μL EB），75 V，30～60 min，紫外线灯下观察并照相，用Kodak Digital Science 1D Image Analysis Software及GD1数字化凝胶成像分析仪扫描，计算mdr1基因与βactin的比值。

1.4 统计学处理

应用医学统计学软件SPSS 12.0处理，结果用±s表示，数据间比较用F检验及χ2检验。

2 结果

2.1 AML病人mdr1基因的表达

AMLP组、AMLC组、AMLR组和对照组mdr1基因表达值分别为0.78±0.76、0.54±0.45、1.64±1.75、0.20±0.13，AML病人mdr1基因表达值高于对照组，且AMLR组高于AMLP组、AMLC组，差异有显著性(P<0.001)。见图1。

图1 mdr1基因表达的RTPCR检测

①Marker；②AMLP；③AMLR；④AMLC；⑤AMLM5；⑥Normal；⑦K562/A02；⑧K562

根据对照组和AML各组mdr1基因在不同组别的表达，将mdr1/βactin的比值≥1.0定为mdr1基因阳性表达，对照组mdr1与βactin比值均<0.1，根据此标准，AMLR组mdr1基因阳性表达率显著高于AMLP组和AMLC组，差异有显著性（χ2=9.578、8.324，P<0.05）。见表1。表1 各组AML病人mdr1基因阳性表达组别n阳性例数阳性率AML病人临床耐药组mdr1基因阳性表达率显著高于非临床耐药组，差异有显著性（χ2=32.42，P<0.01），CR率非临床耐药组显著高于临床耐药组，差异有显著性（χ2=49.63，P<0.01）。见表2。

表2 AML病人mdr1基因表达与临床耐药的关系组别nmdr1阳性(例)表达率(χ%)CR(例)CR率(χ%)临床耐药251768.0416.0非临床耐药40410.03895.0

3 讨论

白血病细胞对多种化疗药物产生耐药性是造成白血病化疗失败的主要原因，是血液肿瘤治疗亟待解决的问题。关于MDR的形成机制，近来已成为国内外研究的热点之一。近30年的研究发现，多药耐药的机制非常复杂，其中多药耐药基因mdr1编码的P糖蛋白（Pgp）的阳性表达被认为是血液肿瘤耐药产生的主要机制[3]。推测Pgp可能通过3种方式引起MDR：①药物被动扩散入细胞后，在浆膜面与Pgp结合并被泵至细胞外；②基于许多抗癌药物均具有亲脂疏水的特点，认为药物与Pgp在脂质双分子层内结合，未进入肿瘤细胞即被泵出；③进入胞内的药物由Pgp泵入胞质内膜腔，再通过出胞作用排出细胞。Pgp在人体大多数正常的组织中均低表达，而在MDR细胞中高表达，且Pgp表达的增加与MDR耐药株的耐药程度呈正相关。LOO等[4]的研究表明,Pgp与药物的结合是一种底物诱导契合机制，这种机制决定了Pgp具有能作用于大范围的不同结构化合物的特性。总之，Pgp可对多种化疗药物产生耐药，从而造成化疗失败。因此，检测AML病人mdr1基因的表达对于了解病人的耐药情况，采取逆转耐药与化疗同时进行治疗具有一定的临床意义。

本文应用RTPCR检测了65例AML病人和对照组mdr1基因的表达情况，与大多数报道不同的是，我们分组研究了初发、CR和复发难治AML病人mdr1基因的表达，研究结果显示,AML病人mdr1基因的表达阳性率高于对照组；复发难治组mdr1阳性表达率显著高于初诊组和缓解组，mdr1基因在复发组中表达率高，提示经过长期化疗的筛选，耐药细胞株存活或者经药物诱导产生耐药，是复发组急性白血病诱导缓解率低、预后差的原因。吴少玲等[5]的研究显示,急性白血病病人mdr1表达明显高于对照组，孟繁军等[6]研究也表明复发组和临床耐药组表达水平明显高于初治组和完全缓解组。另有研究显示，Pgp阳性白血病细胞内DNR/Rh123的浓度显著低于Pgp阴性细胞，并且细胞内DNR/Rh123的浓度随着样本Pgp阳性率的增加而降低[7]。

本实验还探讨了mdr1基因与AML病人临床耐药及疗效的关系，结果显示，AML病人临床耐药与mdr1基因阳性表达密切相关，临床耐药组mdr1阳性表达率显著高于非耐药组；mdr1基因阴性表达组的CR率明显高于mdr1基因阳性表达组，mdr1基因阳性表达严重影响CR率。因此我们推测，mdr1基因阳性表达是判断病人对诱导治疗是否耐药的可靠预测指标，可作为检测临床耐药和判断预后的指标之一。有研究结果还表明，部分mdr1基因表达阴性的病人也出现了耐药，提示耐药现象的出现不是单一的一种基因或蛋白参与的结果[8]。谭耀红等[9]在分析K562/A02细胞的耐药机制时发现，mdr1 mRNA明显升高，TOPⅡmRNA明显下降，Bcl2表达增高，GST活性增强，端粒酶活性增强，Pgp和sorcin过表达，进一步说明了耐药机制的复杂性。

【参考文献】

[1]YANG C Z, LUAN F J, XIONG D S, et al. Multidrug resistance in leukemic cell Lane K562/A02 induced by doxorubicin[J]. Acta Pharmacologica Sinica, 1995,16(4):333337.

[2]BAILLY J D, MULLER C, JAFFREZOU J P, et al. Lack of correlation expression and function of Pglycoprotein in acute leukemia[J]. Leukemia, 1995,9:799807.

[3]LEE W P. Purification, cDNA cloning and expression of human sorcin in vincristine resistance HOB1 lymphoma cell lines[J]. Arch Biochem Biophysic, 1996,325(2):217226.

[4]LOO T W, BARTLETT M C, CLARK D M. Substrateinduced conformational changes in the transmembrane segments of human Pglycoprotein. Direct evidence for the substrateinduced fit mechanism for drug binding[J]. J Biol Chem, 2003,278:13603 13606.

[5]吴少玲,张殿红,贾秀珍. nm232H1基因在急性白血病中表达及与多药耐药关系[J]. 齐鲁医学杂志, 2005,20(2):122125.

[6]孟繁军,罗兵,曲彦. 急性白血病多药耐药基因MDR1表达及临床意义[J]. 青岛医学院学报, 1999,35(3):181183.

[7]WANG Y H, MOTOJI T, MOTOMURA S, et al. Recovery of drug sensitivity by MS209, a new multidrug resistance reversing agent, on acute myelogenous leukemia blasts and K562 cells resistant to adriamycin cell line[J]. Eur J Haematol, 1997,58:186194.

[8]TAN Y H, LI G Y, ZHAO C H, et al. Expression of sorcin predicts poor outcome in acute myeloid leukemia[J]. Leukemia Research, 2003,27(2):125131.

[9]谭耀红,赵春华,杨纯正. 用cDNA Array分析K562/A02细胞多药耐药机制[J]. 中国医学科学院学报, 2001,23(3):272274.

【复发及难治急性髓细胞白血病病人多药耐药基因检测及意义】 髓细胞白血病

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