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921方[1]由龙葵、猪苓、莪术、女贞子、王不留行、补骨脂组成。在前期的实验中发现,其具有一定的体内和体外抗肿瘤药效[2],且毒性较小。为进一步了解其抗肿瘤作用机理,对其进行实验研究。 职称论文怎么发表
1 实验材料
1.1 药物
中药复方921,将莪术提取挥发油,药渣和猪苓、龙葵混合,水提并浓缩至稠膏；另取补骨脂、王不留行、女贞子用乙醇提取至稠膏；二者合并,混合、干燥、粉碎,制成颗粒,喷加入挥发油,密封包装,于阴凉干燥处保存。
1.2 细胞株、试剂
前列腺癌PC-3M细胞株,北京大学泌尿外科研究所传代保存；RPMI 1640培养基、胰酶,均为GIBCO产品；小牛血清,杭州四季青公司产品。3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)、3H-尿嘧啶核苷(3H-UR)、3H-亮氨酸(3H-Leu)均为中国原子能研究院产品。丽春红S(poncean S)、SDS Na(十二烷基磺酸钠)、DTT、过硫酸胺(APS)、TEMED、聚丙烯酰胺(Acrylamide)、小牛血清白蛋白(BSA)、Tween 20均为美国Sigma公司产品。NP-40、考马斯亮蓝G250为FLUKA公司产品。考马斯亮蓝R-250,英国进口分装、中国医药公司北京采购供应站供应。Triton X-100由香港FARCO公司提供。苯甲基磺酰氟(Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride,PMSF)为宝灵曼公司进口产品。琼脂糖(Agarose)为Promega公司产品。三羟甲基氨基甲烷(Tris)为Gibco公司进口。
1.3 仪器
Beckman LS-9800型液闪计数仪。COULTER EPICS-XL型流式细胞光度仪、碘化丙啶(propidium iodide；PI)均为美国Sigma公司产品。
2 实验方法
2.1 DNA、RNA和蛋白质等大分子生物合成检测
取对数生长期的人前列腺癌细胞PC-3M,消化计数制成2×105/mL的细胞悬液,按每孔100 μL接种于96孔板,置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h。随后,加入100 μL含不同浓度药液和溶剂对照的培养基,同时设空白对照组(不加细胞),每组平行3孔,置于培养箱继续培养12、24 h。在终止作用前4 h,每孔加入3H-TdR、3H-UR和3H-Leu,终浓度为1 μCi/孔。4 h后吸出含同位素标记的溶液,每孔加入0.25%胰酶60 μL,于37 ℃消化30 min。用自动细胞收集器将每孔细胞分别收集于玻璃纤维膜上,蒸馏水冲洗20次,取出膜,置于红外烤箱中80 ℃干烤15 min,剪下膜片,分别置于经相应标记的液闪瓶中(内装4 mL闪烁剂、0.4%PPO和0.01%POPOP的二甲苯溶液),暗处放置15 min后,用液闪计数仪测定每个样品的cpm值。 职称论文怎么发表
2.2 细胞周期检测方法
取处于对数生长期的PC-3M肿瘤细胞,制成浓度为3×105/100 mL培养瓶的细胞悬液。24 h后分成4组,分别为对照组和高、中、低(贮存母液稀释度：1∶5、1∶10、1∶20)不同药物剂量组。分别于加药后24、48、72、96 h,收集贴壁和悬浮细胞,离心后用4 ℃预冷1×PBS洗涤,再离心,经预冷1×PBS溶解后加入70%乙醇5mL固定过夜。离心去乙醇,用预冷1×PBS溶解,再次离心并溶解于0.5 mL Propidium iodide染液(PI 2 μg/mL,RNase 1 mg/mL,Glucose 1 mg/mL,PBS 1 mL)中。置于4 ℃暗处染色反应1 h。随后经300目筛过滤后上样,进行流式细胞仪检测。
2.3 Western Blot杂交分析蛋白表达方法
用921方稀释液1∶5、1∶10、1∶20的不同浓度,分别作用于生长期细胞72 h,提取收集全部细胞,提取总蛋白,用G-250法测定蛋白含量,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,并用半干电转法将蛋白转移到硝酸纤维素膜上,随后用TTBS在4 ℃封闭非特异结合位点过夜,经一抗孵育、漂洗,二抗孵育后,与Western显色底物在室温下反应10 min,用BCIP/NBT显色系统显示(Promega),数码相机照相。
3 结果
3.1 对前列腺癌细胞DNA、RNA和蛋白质等大分子生物合成的影响
921方对前列腺癌细胞株PC-3M的DNA合成有抑制作用，并呈现出作用时间和作用剂量依赖性(见表1),而对细胞的RNA和蛋白的合成则无显著影响。921方对前列腺癌细胞的生长抑制作用可能与抑制细胞内DNA等大分子的有效生物合成途径有关。表1 921方对前列腺癌细胞PC-3M的DNA合成抑制率(略)
3.2 对前列腺癌细胞株PC-3M细胞周期的影响
921方体外加药,在不同稀释度、不同作用时间时均体现出S期阻滞作用,并具有剂量依赖性的增加细胞S期比例,尤其经921方1∶5稀释度作用72 h后,甚至使得G2/M期细胞缺失,使得细胞完全阻滞在S期。这与前述的DNA合成抑制有一定联系。以此推测,药物可能通过影响S期中的某些重要功能分子而起到S期阻滞作用。结果见表2。表2 921方对体外PC-3M细胞周期分布的影响（略）职称论文怎么发表
3.3 921方对S期相关蛋白CyclinA、CyclinB、p21、p27表达的影响
Western Blot分析表明,921方对CyclinA的蛋白表达有明显的抑制性影响,并呈现出一定的量效关系,中剂量对p21蛋白的表达也有一定影响,但对p27和CyclinB则影响不大(见图1)。结果显示,药物对前列腺癌细胞PC-3M的S期阻滞作用,可能通过诱导S期相关蛋白CyclinA的表达下调而起作用。
3 讨论
921方抗肿瘤作用的机理可能与抑制肿瘤细胞DNA合成、诱导CyclinA蛋白表达下调并进而导致细胞周期S期阻滞有关。细胞周期分为G1、S、G2、M共4个期,S期的主要特征是DNA的合成与复制,与S期相关的重要分子有许多,如DNA聚合酶、组蛋白、CyclinA、CyclinB、cdk1、cdk2、E2F、pRB、p27、p21、p107等,其中细胞周期蛋白和其激酶、抑酶常形成为一功能复合物,并发挥重要作用。CyclinA蛋白是一种细胞周期蛋白,在细胞进入S期后表达显著增高,并与cdk2和p27结合成复合物[3],在S期中发挥重要作用。而在S-G2期转换中,CyclinA则转而与cdk1结合,并继续发挥作用。大部分影响细胞周期的药物都是通过影响细胞的CDKs或CIKs等蛋白激酶而起作用,而921方是通过何种途径诱导CyclinA表达下调,尚有待深入。
