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【摘要】 目的 观察慢性阻塞性肺疾病(COPD)并发肺动脉高压(PAH) 病人外周血内皮祖细胞(EPC)数量和功能的改变,探讨其在COPD并PAH发病中的作用。方法 选择非COPD非PAH (非COPD组) 病人15例、COPD非PAH (COPD组)病人15例、COPD并PAH (COPD+PAH组)病人30例,用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞,将其接种在人纤维连接蛋白包被培养板上,培养7 d 后对贴壁细胞进行细胞化学分析。通过集落形成试验、改良的Boyden小室和黏附能力测定实验计数EPC的数量、测定EPC的迁移和黏附能力。结果 与非COPD组及COPD组相比，COPD+PAH组外周血EPC数量明显减少,黏附和迁移能力显著降低，差异有显著性（F=9.79～15.42,q=3.578～7.963,P<0.05）；且EPC数量及黏附、迁移能力与肺动脉压力呈负相关（r=-0.87、-0.89、-0.93,P<0.01）。结论 COPD病人PAH的发生可能与循环EPC数量减少、迁移和黏附能力降低有关，EPC数量和功能可作为评价COPD并PAH病人预后的一项指标。
【关键词】 肺疾病 阻塞性 高血压 肺性 内皮祖细胞
［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the changing of number and function of endothelial progenitor cells (EPC) in patients with pulmonary hypertensive arterial (PHA) secondary to chronic obstructive pulmonary disease (COPD).MethodsMononuclear cells from nonCOPD without PAH patients (nonCOPD group, n=15), COPD patients without PAH (COPD nonPAH group, n=15) and patients with PAH secondary to COPD (COPD and PAH group, n=30) were investigated. Total mononuclear cells were isolated from peripheral blood by Ficoll density gradient centrifugation. EPC number and migration were measured by colony forming unit EPCs (CFUEPCs) assay and modified Boyden chamber assay, respectively. EPC adhesion assay was performed by replating those on fibronectincoated dishes, then adherent cells were counted.ResultsThe number of CFU and migration, adhesion activity of circulating EPCs in COPD and PAH group was significantly lower than that in nonCOPD group and COPD nonPAH group. There was significant negative correlation between the level of PAH and the number of CFU, and adhesion and migration activity of circulating EPCs.ConclusionThe number of CFU and migratory, adhesive activity of EPC in patients with PAH secondary to COPD is significantly decreased.
［KEY WORDS］pulmonary diseases, obstructive; hypertension,pulmonary; endothelial progenitor cells
低氧性肺动脉高压（PAH）是慢性阻塞性肺疾病（COPD）发病过程中的中心环节, PAH的产生及严重程度明显影响着COPD和肺心病的病程及预后。 近年来的研究结果表明, 内皮损伤及功能障碍在PAH的发生、发展中扮演了重要角色。内皮祖细胞(EPC)不仅参与人胚胎血管生成, 而且参与出生后血管新生和内皮损伤后的修复过程[1～ 3]。本文观察COPD并PAH病人外周血EPC的数量及迁移、黏附能力的变化，探讨EPC在COPD并PAH发病中的作用。现报告诉如下。
1 对象和方法
1.1 研究对象
2005年10月～2006年11月，选择我院住院COPD病人45 例，男32例，女13例；年龄48～73岁，平均（61.5±12.9）岁，符合第二次全国肺心病会议制定COPD诊断标准。其中非PAH (COPD组)病人15例，COPD并PAH (COPD+PAH组)病人30例。非COPD非PAH(非COPD组)病人15例, 男11例，女4例；年龄43～70岁，平均（53.6±17.8）岁。排除外伤、溃疡、视网膜病、近期外科手术、炎症、肿瘤等影响EPC疾病者, 近3个月无急性心肌梗死发生, 入选病人均未用过他汀类药物。
1.2 实验方法
1.2.1 超声心动图测定肺动脉压力 应用惠普公司5500型彩色多普勒超声仪，选择心尖部四腔心切面观察三尖瓣反流情况，将测得的反流压差加右房收缩压（平均值为1.06 kPa）作为肺动脉收缩压。肺动脉收缩压>3.99 kPa为PAH。
1.2.2 EPCs分离、培养[4，5] 采集受试者外周静脉血，用密度梯度离心法分离单个核细胞（MNC），将其接种于包被有人纤维连接蛋白（HFN，Gibico公司）的24孔培养板，用EBM2培养液（Clonetics公司）培养4 d后换液，继续培养至第7天，分离贴壁细胞。
1.2.3 EPC的染色与鉴定[4～6] 向贴壁细胞中加入经DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(acLDLDiL,Molecular Probe公司）， 37 ℃温育1 h后，经20 g/L多聚甲醛固定后，用PBS浸洗，再加入FITC标记的荆豆凝集素I(FITCUEAI,VECTOR公司），温育1 h后，于倒置荧光显微镜下观察，摄取DiLDL并结合FITCUEAI（即双染色阳性）者为正在分化的EPC。
1.2.4 EPC计数 采用集落形成试验方法。分离EPC，用20 mg/L HFN包被6孔板，每孔置入5×106 MNC，孵育2 h，收集未贴壁细胞（包括EPC），调整密度为每孔1×106细胞，置入包被有HFN的24孔板中，继续培养5 d，计数每个样本中每孔的克隆数。
1.2.5 黏附能力检测[7] 用1 g/L胰蛋白酶消化、收集贴壁细胞，将同等数目的EPC接种在包被有人HFN的24孔培养板，培养30 min，用PBS洗去未贴壁的细胞，计数贴壁细胞。
1.2.6 迁移能力检测[8] 用1 g/L胰蛋白酶消化、收集贴壁细胞，将EBM2培养液加入改良的Boyden小室（江苏海门麒麟医用仪器厂）的下室，将2×104 EPC悬浮在EBM2培养液后注入上室，37 ℃培养24 h，刮去滤膜上面未移动的细胞，用甲醇固定，Giemsa染色，显微镜下随机选择3个视野，计数迁移到底层的细胞数。
1.3 统计学处理
计量资料以±s表示，组间资料比较采用方差分析，相关性采用直线相关分析。
2 结 果
2.1 EPC的形态与特征
分离获得的MNC培养7 d后形成了梭形的内皮样细胞。 EPC具有EC的特性，吞噬DiLDL、结合FITCUEAI后，在倒置荧光显微镜下分别显红色和绿色，双染色后呈黄色。
2.2 各组EPC数量及黏附、迁移能力的比较
COPD+PAH组EPC数量、黏附和迁移能力显著低于其他各组（F=9.79～15.42,q=3.578～7.963,P<0.05）； COPD组EPC数量较非COPD组略低, 但其差异无统计学意义(q=1.562,P>0.05)，黏附能力及迁移能力较非COPD组明显减低，差异均有统计学意义（q=9.031、8.264，P<0.05）。见表1。 表1 各组外周血EPC数量和功能测定结果
2.3 COPD+PAH病人肺动脉压力与EPC数量、迁移和黏附能力的关系
相关分析显示，COPD+PAH组病人肺动脉压力与EPC数量、迁移和黏附能力均呈负相关(r=-0.87、-0.89、-0.93,P<0.01)。
3 讨 论
COPD是一种气流受限呈进行性、不完全可逆性，并且与肺对毒性颗粒或气体的异常反应有关的疾病状态。其发病率和病死率极高,影响预后的因素有气道痉挛、通气量、高碳酸血症和PAH。PAH与低氧血症互为因果, PAH一旦形成, 肺心病就可能接踵而至,提示预后不良。因此，研究PAH的发生机制, 寻求理想的降低肺动脉高压的方法对改善病人预后是极其重要的。近年的研究表明，肺细小动脉内皮损伤、管腔狭窄或堵塞及可供征用的肺小动脉数量减少在PAH的发生、发展过程中起着非常重要的作用[9]。肺血管的重塑是COPD肺动脉高压形成的主要因素。EPC是一类能增殖并分化为血管内皮细胞，但尚未表达成熟血管内皮细胞表型，也未形成血管的前体细胞。近年一些研究显示,血管损伤后,循环EPC能够向损伤血管归巢,并 定向分化为血管内皮细胞,加速损伤血管内皮的修复[10]。动物实验和临床研究结果均证实, 新生血管中25%的内皮细胞是由EPC分化而来的[11]。同时，在组织缺血、血管损伤、心血管危险因素、严重烧伤等刺激及药物作用下，循环EPC数量可发生变化[12]。因此, EPC可能参与COPD病人PAH的发生和发展。
最近，KENTARO等[13]的研究显示，骨髓来源的细胞可以被动员至肺动脉高压处的血管并参与PAH的肺血管重塑，这一过程与骨髓来源的细胞可以分化为成纤维细胞有关，而成纤维细胞在组织重塑、创伤愈合以及各种纤维化失调中起重要作用，参与血管重塑的病理生理过程。KIMIO等[14]的研究显示，内源性促红细胞生成素可以促进慢性低氧小鼠骨髓来源的EPC的动员，阻止其PAH进程，减轻右心室肥厚和肺血管重构。由于EPC在维持内皮功能完整中具有重要作用，因而EPC移植治疗PAH也引起了国内外学者的兴趣。最近，NAGAYA等[15]应用野百合碱诱导的肺动脉高压裸鼠模型研究显示，异种EPC移植治疗能使肺动脉阻力下降16%，基因转染的EPC能使肺动脉阻力下降35%，且基因转染EPC的存活率更高。
本文结果表明，非COPD及COPD非PAH病人的EPC数量是COPD并PAH病人的1.90倍，COPD并PAH病人外周血EPC黏附能力和迁移能力显著降低。COPD并PAH病人外周血EPC减少的原因目前尚不清楚，可能与其促进EPC凋亡、干扰调节EPC分化动员的信号通路有关。此外，我们观察到随着COPD病人肺动脉压力的增高，外周血EPC数量减少，黏附和迁移能力降低。提示COPD病人PAH的发生可能与循环EPC数量减少和功能降低有关。EPC数量减少及功能损伤可能导致COPD病人肺小动脉自身修复能力降低。 因此，我们认为EPC数量和功能可作为评价COPD并PAH病人预后的一项指标，同时本文研究结果为祖细胞移植治疗COPD并PAH提供了新的理论依据。
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