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【摘要】目的：建立一种简便且可靠地鉴别大黄及含大黄中成药物真伪的方法。方法：采用Lichrospher C18色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-乙腈-水(35：5：60)，流速1.0ml/min，检测波长320nm，对正品大黄、伪品大黄及以正品大黄所生产的清肺抑火片中土大黄苷含量进行测定。结果：土大黄苷进样量在0.316-3.69ug范围内与峰面积呈良好的线形关系(r=0．998)，平均回收率99.18%；伪大黄即河套大黄中检测出土大黄苷，而正品大黄及其中成药制剂清肺抑火片中均未检出土大黄苷。结论：该方法简便、快速、准确可靠，具有良好的重现性和灵敏度高，可作为鉴别大黄及部分含大黄中成药真伪的有效方法。
【关键词】 高效液相色谱法；河套大黄；土大黄苷；清肺抑火片
国家药典规定，正品大黄来源于蓼科，属于掌叶组植物的干燥根及根茎。以个大，色黄而得名。品种包括掌叶大黄、唐古特大黄和药用大黄，主产地在四川、青海、甘肃等地，栽培或野生，产量并不大[1]。伪品大黄主要来源波叶组的波叶大黄，包括河套大黄、华北大黄、藏边大黄等，主产地在华北、新疆、西藏、青海等地。波叶组的伪品大黄产量大，流散广，市场中较为常见，但其并非药典收藏的正品大黄，因此均属伪品。正品大黄具有攻积滞、清湿热、泻火、凉血、祛瘀、解毒等功效，是临床较为常用的一种药品。而伪品大黄则不具备这样的功效。目前由于正品大黄产量有限，市面上涌现出大量伪品大黄以假乱真、以次充好，严重干扰医疗市场，甚至威胁患者的生命健康，因此，鉴别大黄真伪至关重要。正品大黄无论从宏观还是微观，甚至理化性质检测结果均与伪品大黄有着很大区别，鉴定的方法也多种多样。本文采用高效液相色谱法（HPLC法）对大黄真伪进行鉴别，并选取清肺抑火片为含大黄中成药物的代表，鉴定其所含大黄真伪，现报道如下。
1方法
1．1 仪器与试药：仪器：日本岛津（LC-2010A）高效液相色谱仪；TG332A型微量分析天平(上海分析天平厂)。试药与试剂：土大黄苷对照品，批号110756-200110，来源于中国药品生物制品检定所；河套大黄取自本省药品检验所药材标本室，正品大黄药材购自我省药材公司，上述2种药材均经本所主任药师鉴定。清肺抑火片市售品购自永安大药房，生产厂家云南金柯制药有限公司，批号20094331。
1．2色谱条件:色谱柱为Lichrospher C18柱(0.25cm×4.6mm，5um)，流动相为甲醇-乙腈-水(35：5：60)，检测波长320nm。流速1mL/min，SYG柱温25℃。
1.3 对照品溶液的配制:精密称取土大黄苷对照品3.39mg，置25mL量瓶中，以甲醇定容，摇匀，作为对照品溶液。
1．4 供试品的制备:取正品大黄及河套大黄，研成细粉，精确称取药材1．0 g，加入甲醇25ml，超声处理后，过滤，滤渣用少量甲醇洗涤3次，合并滤液和洗液，减压浓缩，残渣加甲醇溶解，转移至100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。取清肺抑火片20片，去包衣后精密称量、研细，再精密称取适量(约相当于2片量)，置锥形瓶中，精密加入25mL甲醇，超声振荡20min，放冷，用甲醇补充至刻度，精密吸取续滤液10mL，即为供试品液。
2 结果
2．1 色谱条件及系统适用性:色谱柱：Lichrospher C18(150mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-乙腈-水(35：5：60)，流速1.0ml/min，检测波长320nm，色谱图见图1。
图1 A 对照品B 河套大黄C 正品大黄
2．2线性关系:精密称取土大黄苷对照品14mg，置50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1mL分别含0．28mg、0．32mg、0．16mg的混合液。作为对照品储备液，各吸取对照品储备液50、100、200、300、400、500、600于5mL量瓶中，用甲醇定容。进样测定，以对照品进样量为横坐标，峰面积分值为纵坐标绘制工作曲线，得到回归方程：Y=0.37+2648.20m，r=0．998。结果表明，土大黄苷进样量在0.316-3.69ug时，峰面积与进样量呈良好线性关系。
2．3精密度试验:精密量取对照品溶液，重复进样6次，每次进样量10ul，测得土大黄苷含量，相对标准差RSD为0．28%。
2．4 加样回收率试验:精确称取已测定的大黄样品5份，每份0.25g，分别精密加入对照品储备液1.3mL，对照储备液1.6mL，按照供试品溶液制备同法操作并按上述条件测定。结果为99.18%，RSD为0.82%。
2．5 样品稳定性试验:按供试品液制备方法处理，并按色谱条件测定记录色谱图，以外标法峰面积计算RSD为0.61%。结果表明：供试品溶液室温下放置在12小时内稳定。
2.6 样品测定:取河套大黄样品及清肺抑火片分别按上述方法制备供试品溶液，精密量取供试品溶液及对照品溶液各5 uL，注入液相色谱仪，记录峰面积，计算样品中土大黄苷的含量及RSD。结果显示：河套大黄含土大黄苷4.05%，RSD0.41%；清肺抑火片及正品大黄中不含土大黄苷。 3讨论
大黄是我国特产中药材之一，以四川西部和甘肃的大黄质量上乘，药用价值最好。我国药典规定的符合药用正品的大黄为蓼科植物掌叶大黄、唐古特大黄及药用大黄的干燥根茎和根。近年来，随着中药事业的发展，中药品种逐渐增多，饮片使用数量也日益加大，加之野生大黄逐渐减少，种植栽培的大黄亦不能满足市场需求，导致陆续出现华北大黄、河套大黄、藏边大黄、天山大黄的根伪充大黄的情况，且伪品大黄日益增多。大黄为苦寒泻下之物，其荡涤肠胃、峻下力猛、走而不守，同时也有活血化瘀、破癥瘕积滞的功效。但由于目前中药市场存在着以伪充真、以劣充好、生熟不分等情况，严重影响了大黄饮片及含大黄成分的中成药的质量、信誉和使用效果，甚至影响人民群众的健康水平。本研究就正品大黄与伪品大黄的鉴定方法进行了研究，以期杜绝上述现象的发生，使药材用名实物相符，确保疗效。
正品大黄与伪品大黄有多处异同点，可通过性状、理化等方法鉴别出正品大黄。①性状鉴别：正品大黄根呈圆柱形、圆锥形或不规则块状，长317 cm．直径3～1l cm，外皮棕褐色，除去外皮表面黄棕色至红棕色，质坚实，断面淡红棕色．木部发达，具放射纹理。根茎横切面髓部较宽，可见星点，排列呈环状或散在，气清香，昧苦而微涩．嚼之粘牙，有沙砾感。伪品大黄：根呈圆柱形或纵刮皮不规则条块状、圆柱形的长4～8 cm、直径1～4cm，外皮褐棕色，多已刮腺．表面黄棕色．横断面橙红色至黄棕色，根木部宽广，射线细密，红棕色。根茎横切面无星点，气不清香而浊，味先涩后苦。②理化鉴别：正品大黄其粉末的稀乙醇浸出液点于滤纸上，滴加稀乙醇扩散后，显黄色至浅棕色环，置紫外光下观察，显棕色至棕红色荧光。伪品大黄其粉末稀乙醇浸液点于滤纸上，滴加稀乙醇扩散后，显黄色至浅棕色环，置紫外光下观察，显蓝紫色荧光。③显微鉴别：正品大黄粉末呈黄棕色，草酸钙簇晶20～1601a，棱角多短钝，具有缘纹孔、网纹、螺纹及环纹导管，淀粉粒非常多，呈类球形或多角形，单粒淀粉直径3～45皿，复粒由2～8粒组成。伪品大黄其粉末草酸钙簇晶20～85 ，棱角尖于正品大黄，单粒淀粉直径3～241a，粒复由2～6粒组成，较正品大黄小而少[2]。从以上的叙述可以掌握真伪大黄的明显区别点，有助于确保临床用药的安全性、有效性，保证中药质量、信誉和使用效果。但同时宏观鉴别有赖于经验，而上述几种理化鉴别方法敏感性及准确率尚不够理想，HPLC法是一种更为准确方便的鉴定方法。
高效液相色谱是近三十年来出现的一种新的色谱技术，是色谱法的一个重要分支，其发展速度相当迅猛，短短时间内，已经广泛应用于临床及实验室研究中。采用液相色谱及气相色谱相结合的方法，以液体为流动相，采用高压输送系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对样品的分析。高效液相色谱具有高效、高灵敏度、应用范围广、分析速度快、选择性好等特点，同时色谱柱可反复使用、样品易回收，更适用于分离沸点高、对热稳定性差、分子量较大的物质，对于分析体内药物浓度、体内内源性物质、复杂中药成分尤其适合。中药是一种多成分、多元素混杂的混合体系，由多种药物配合组成方剂或中成药物，发挥多种成分的综合作用达到最佳治疗效果。因此，中药在治疗疾病中具有独特的疗效和优势，但由于其成分的复杂性，也导致了成分分析存在很大的困难，给药品质量监督带来较大的难度。高效液相色谱的应用给中药鉴定开辟了新的天地，借助高效液相色谱的特点可以更为准确、灵敏的鉴定中药及中成药物的有效成分，保证药物的疗效及患者的切身利益[3]。易华平等[4]采用HPLC法测定不同产地淫羊藿中淫羊藿苷的含量；孙蓉等[5]采用HPLC法测定金匮肾气片中马钱苷的含量均取得了良好的效果。本研究就HPLC法鉴定中药大黄及含大黄中成药的真伪进行了研究。土大黄苷是伪品大黄的成分之一，几乎没有泻下的作用[6]，正品大黄中不含有该物质，因此通过HPLC法检测土大黄苷含量可以进行真伪大黄的区分。通过本次实验，建立了鉴定正品大黄及伪品大黄的方法，能够准确判定样品中是否含有土大黄苷，从而为鉴定大黄及含大黄中成药物的真伪提供了一种精密、简便易行、安全可靠的方法，为临床用药安全提供了强有力的技术支持。
综上所述，中药一直以来被人们认为毒性低、安全性高。但近年来一系列国内外有关中药不良事件的报道，使人们对中药的安全性及疗效产生了质疑。中药复方的药效是建立在多种复杂化学成分综合作用基础之上的，质控较为困难。本文采用HPLC法测大黄真伪及含大黄中成药物中主药大黄的真伪，为更加全面有效建立中药制剂质量标准提供了详尽的理论依据，对提高中药复方的安全性具有重大意义。为更好地保证原方临床疗效，确保临床用药的安全性、有效性，保证中药质量、信誉和使用效果，有必要对该方法进行深入研究和广泛应用。参考文献
[1]中华人民共和国药典委员台．中国药典(一部) 2000年版．北京：化学工业出版社．2000
[2] 许靖.大黄真伪鉴别[J].天津药学.2001，13（6）：51-52
[3] 李伟星，焦玉英.药物研究中HPLC的应用.科技论坛:9
[4] 易华平.测定不同产地淫羊藿中淫羊藿苷的含量[J].湖南中医杂志, 2007 (23): 67-68
[5]孙蓉. HPLC法测定金匮肾气片中马钱苷的含量[J].云南中医中药杂志，2010（31）：65-66
[6]卢伟.广金钱草及土大黄有效成分研究与应用[D/DB].中文学位论文数据库，2003：46-47