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【关键词】31P NMR cos-7细胞 pH
1 引言
细胞内PH一直都是生物化学和生物学研究的重点，也是研究最基础的部分。正是细胞内外的PH离子梯度差，使离子在细胞内PH的影响下进行内外转换，从而产生离子通道，影响细胞的功能和代谢[1]。所以细胞内的PH和离子通道的分析研究，对一些生理的发展和病理改变起到重要的作用。为了研究游离离子Ca2+、Li+、Mg2+等及通道的变化，现在已经创建了许多新的生物分析方法。这些种分析方法具有连续动态、长时间、无损伤的优点。为观察细胞代谢，能量转换及病理生理变化等提供了新的研究方法。因为细胞内功能和代谢受细胞内PH的影响，所以部分酶的活性与其有着紧密的联系。细胞代谢及转化的生理学数据，是由细胞内PH决定的。过去测定细胞内PH的方法是弱碱弱酸分布法和Pt/H电极法，缺点是数值不准确，而且不能反复检测。当前广泛应用的是PH敏感性电极法，测得数值准确无误可靠性高，可做检测时必须将微电极插到细胞内测定数值，这样就破坏了完整的细胞膜，所以不能完全准确的测定在正常细胞膜完整的生理情况下细胞内PH的准确数值。在科学的不断发展创新中核磁共振的产生，给生理学和生物化学的研究指引了新的研究方向。人们所重视的问题一直是细胞内PH的测定。应用多的方法有NMR法测定pH，可以采取19F NMR方法和31P NMR方法。利用NMR检测得到的pH在条件适宜情况下其准确度可以达到0.06pH单位。对于干扰生物样品信号会使测定的误差增加。实验所建立的31P测定猴的肾细胞cos-7细胞株细胞内的pH的方法，可为cos-7细胞表达的基因转染提供可靠依据。
2 实验部分
2.1 试剂、细胞系及培养条件 小牛血清购自北京元亨圣马生物技术研究所（56℃，30min灭活，置于-20℃冰箱中待用）；细胞系及培养条件（duIbecco EagIe’s minimum essentiaI medium（DMEM）粉剂购自Gibco公司。
将猴的肾细胞cos-7细胞株接种在含有10%的胎牛血清中，100mg/L链霉素及100U/mL青霉素DMEM培养溶液中，在温度为37℃环境下，CO2含量在5%的空气及饱和湿度CO2培养箱中培养。 2.2 实验方法
2.2.1 细胞的处理 在使用核磁共振测定之前，用台盼兰对细胞进行染色处理，与显微镜下计数活动度要在95%以上，用0.25%胰蛋白酶消化收集，在对数生长期的cos-7 细胞，温度在4℃环境下以1000r/min离心2min。用温度为4℃的0.9%的氯化钠溶液悬浮细胞，所用溶液的体积要等于细胞体积的两倍，用离心机离心去除胰蛋白酶中的含磷物质及培养基。重新用相当于细胞体积0.2倍的0.9%氯化钠溶液悬浮细胞，放入消毒处理后的2mm核磁管中，此时细胞在溶液中的浓度为3.4×108细胞/ml
2.2.2 31P NMR谱测试 JNM-ECA-400超导核磁共振仪（日本电子公司），工作频率为161.83MHZ，脉冲宽度12.4μs（30°），延迟时间为2s，数据采集点1k，累加次数4691，以亚甲基双磷酸MDP（0.05moI）作外标，化学位移（×10-6）为21.42，实验温度为室温[1]。
3 结果与讨论
3.1 PH值的测算 使用核磁共振检测方法既不破坏细胞的完整，又能检测很微小的细胞及细胞器内的PH，还可以连续动态的测定部分重要细胞做出反应时的PH，对其进行动态跟踪。通过上述实验绘制cos-7细胞31P NMR谱，绘制精准的曲线图，推算出cos-7细胞内的PH值计算公式为；PH=6.79+10g［(δ-1.54)/(7.12-δ)］,根据公式计算得出PH=5.58±0.04。
3.2 31P谱及pH测定条件分析 cos-7细胞是一种SV40病毒的猴的细菌株，它可以减退生长，它的自身蛋白表达很少，是运用较为广泛的真核表达的系统。常用于表达外援基因，成功测定cos-7细胞内的PH值能更好的观察PH是怎样对转染表达产生影响的。
上述实验证明，如想获得更好的NMR信号，应使细胞内的含磷总体数量达到一定的值，必须用活细胞制作成密度较高的细胞悬液达到（108细胞/ml以上）。然而密度较高的细胞悬液在时间很短的范围内会快速发生代谢变化。所以在做细胞处理时动作要快速，在温度为4℃的环境下离心，离心处理完成后要迅速进行值的测定。处理动作慢的情况下细胞的代谢加快，实验测定的谱图里会看见明显增高的无机磷峰值，则检测不到ATP等其它含有磷化合物的峰值。因ATP等含磷化合物会以能量的形式代谢转化为无机磷。
本研究利用31P核磁共振的方法对cos-7细胞内的PH值做测定和分析。达到了对细胞内游离离子及离子通道的核磁共振的分析。
参 考 文 献
[1] 李伟生，罗建，陈忠宁.一种对Cu～(2+)具有灵敏性识别的磁共振成像造影剂的研究: 中国化学会第27届学术年会[Z].中国福建厦门, 2010.