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摘要：目的：通过研究左炔诺孕酮宫内缓释系统（LNG-IUS）治疗子宫内膜异位症（EMs）后TNF-a和MMP-9在在位内膜中表达的变化，探讨LNG-IUS防治EMs复发的作用机制。方法：采用蛋白免疫印迹检测60例EMs患者在位内膜组织中、60例正常内膜组织中TNF-a和MMP-9的表达。选择行开腹或腹腔镜卵巢子宫内膜异位囊肿剥除术患者60例,分为3组：A组(LNG-IUS组)20例; B组(GnRH-a组)20例; C组(孕三烯酮组)20例;D组(术前未用药组)60例。采用蛋白免疫印迹检测4组患者在位内膜组织中TNF-a和MMP-9的表达。结果：1.TNF-a和MMP-9在在位内膜中表达高于正常内膜（P＜0.05）。2.A组（LNG-IUS组）、B组（GnRHa组）、C组（孕三烯酮组）在位内膜组织中TNF-a的表达较对照组均降低（P＜0.05）。A组、B组明显低于C组（P＜0.05）。A组与B组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。3.A组、B组、C组在位内膜组织中MMP-9的表达较对照组均升高（P＜0.05）。A组、B组与C组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：LNG-IUS用于EMs术后复发效果良好，值得临床推广。
关键词：子宫内膜异位症；左炔诺孕酮宫内缓释系统；肿瘤坏死因子a；基质金属蛋白酶-9
中图分类号：R711.71文献标识码：A文章编号：1671-5837(2018)06-0176-03
子宫内膜异位症（endometriosis，EMs）是妇科常见病及多发病之一[1]，影响到十分之一的女性，严重影响了患者的生活质量[2]。目前，手术切除或破坏子宫内膜异位组织是疼痛和其他症状的首选治疗方法，但约有40-45％的患者发生症状复发，27％的患者在5年内需再次手术治疗[3]。术后加行药物治疗是控制复发的必要环节.中华医学会妇产科学分会2015年发布的《子宫内膜异位症的诊治指南》中指出，对于年轻、希望保留子宫者使用口服避孕药或左炔诺孕酮宫内缓释系统(LNG-IUS)[4]。但是由于药物存在一定的副作用，依从性差, 近几年有学者指出，LNG-IUS可用于月经过多、子宫内膜异位症（EMs）和子宫腺肌病（AM）等，并取得良效。EMs的发病由粘附、侵袭和血管生成三部曲组成，TNF-α与血管生成有关，MMP-2、MMP-9与子宫内膜异位灶侵袭有关。因此，本研究以内异症的“种子”在位内膜为切入点,通过研究LNG-IUS对EMs患者TNF-α及MMP-9表达的影响，从而探讨Ems复发的发病机制。
1 材料与方法
1.1 材料
TNF-α（鼠源）抗体购于美国Abcam公司；MMP-9 （兔源）抗体购于美国Santa Cruz 公司；β-actin（鼠源）抗体购自Sigma公司；β-actin引物购自QIAGEN公司。
1.2 方法
1.2.1组织筛选选择
2015年6月~2017年1月在我院行开腹或腹腔镜卵巢子宫内膜异位囊肿剥除术患者60例,术前均常规诊刮，收集其子宫内膜组织作为实验组，所有标本均经病理确诊。选择同期60例因子宫肌瘤行子宫肌瘤剔除术或子宫切除术的非子宫内膜异位患者，收集其子宫内膜组织作为对照。实验组分为3组:A组(LNG-IUS组)20例; B组(GnRH-a组)20例; C组(孕三烯酮组)20例;将子宫内膜异位患者术前诊刮作为对照-D组（术前未用药组)。3组患者年龄、身高、体重和分期等差异均无统计学意义(P>0.05)。入选患者3个月内未均未接受过内分泌治，无其他妇科合并症和内外科严重并发症。
1.2.2研究方法
检测60例在位内膜及60例正常内膜组织中TNF-a和MMP-9的表达。在此基础上，A组于术后即可将LNGIUS（德国拜耳公司产品)）放置到宫内；B组在术后术后第3天给予GnRH－a(曲普瑞林，益普生法国生物制药公司) ，3.75 mg/次，肌肉注射1次/28天，连续应用6个月；C组于术后1周开始服用孕三烯酮胶囊(北京紫竹药业公司,每片2.5mg)每次2.5mg,每3天1次,连续应用6个月。分别于治疗后6个月后进行宫腔镜检查，定点刮取子宫内膜送病理检查。检测三组用药前后在位内膜中TNF-a和MMP-9的表达的变化。
1.2.3 蛋白印记（Western blot，WB）将提取的蛋白样品在配置好的凝胶中上样45ug，电泳，100 V恒压电1.5h将蛋白转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上膜。取出膜，5%脱脂牛奶封闭1h，漂洗，加TBST稀释的一抗(TNF-α，1:200；MMP-9，1:400；β-actin，1:1000)室温孵育2h或4℃过夜。漂洗，加稀释的HRP标记的二抗室温孵育1h。漂洗后显影，凝胶成像仪记录结果，用Quantity One software经行灰度值结果的统计。
1.3 统计学处理实验中所有数据均表示为mean±S.E
使用student-t 检验方法分析实验结果，P<0.05被认为有显著性统计学差异。
2 结果
2.1 在位内膜及正常内膜组织中TNF-α及MMP-9表达情况
TNF-α蛋白在在位内膜(Eu:eutopic endometrium)中表达高于正常内膜(Control)，差异有显著性意义（P＜0.05），见图1。MMP-9蛋白在在位内膜中表达高于正常内膜，差异有显著性意义（P＜0.05），见图2。
2.2三组患者治疗前后在位内膜组织中TNF-α表达情况
A组（LNG-IUS组）、B组（GnRHa组）、C组（孕三烯酮组）在位内膜组织中TNF-a的表达较D组（对照组）均降低，差异有显著性意义（P＜0.05）。A、B组明显低于C组，差异有显著性意义（P＜0.05）。A组与B组比较差异无统计学意义。（图3）
图3 不同处理组TNF-α蛋白的表达
* 代表P<0.05(n=20)。
2.3三组患者治疗前后在位内膜组织中MMP-9表达情况
A、B、C组在位内膜组织中MMP-9的表达较D组均升高，差异有显著性意义（P＜0.05）。A、B、C组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。（图4）
图4不同处理组MMP-9蛋白的表达
* 代表P<0.05(n=20)。
3 讨论
EMs的发病机制尚不明确，研究发现TNF-α在内膜异位症的黏附、侵袭、植入及增殖的过程中都发挥着非常重要的作用。基质金属蛋白酶(MMPs)一方面通过水解细胞外基质和基底膜的大量蛋白，为子宫内膜细胞的侵袭迁移提供条件，另一方面通过调控细胞凋亡过程，抑制子宫内膜细胞程序性凋亡反应，从而导致内膜细胞在盆腔等处异位生长[5]。先前已有研究表明，子宫内膜异位症患者腹膜液中高表达TNF-α，并且发现TNF-α表达水平与疾病的严重性呈正相关[6]。TNF-α可通过MMP-9的基因启动子上的多种核因子结合位点（如AP-1或NF-kB）上调MMP-9的表达[7]。子宫在位内膜通过高表达MMP-9，具备较强的抗凋亡能力和新生血管生成能力，从而在异位种植并向周围组织侵袭。我们的研究也表明，EMs患者的在位内膜组织中TNF-α、MMP-9表达均升高，呈正相关。
EMs手术治疗后的高复发率一直是困扰临床医生的一个难题，目前保守手术治疗后的药物治疗分为口服避孕药类、促性腺激素释放激素激动剂(GnRHa)、孕激素类、雄激素类等[8]。术后短期用药不能有效降低长期复发率,因此长期药物治疗近年来较受关注。其中LNG-IUS作为一种新型的含孕激素的T形宫内节育器，治疗EMs的作用机制尚不明确。目前研究表明,LNG-IUS通过影响EMs患者子宫内膜细胞凋亡、血管形成相关因子、性激素受体、细胞外基质以及CA-125等发挥作用[9]，LNG-IUS在EMs长期治疗及降低复发率方面研究较少,且目前尚无LNG-IUS治疗EMs影响TNF-α、MMP表达的报道。
本研究表明，LNG-IUS组TNF-a的表达明显低于孕三烯酮组，且与GnRHa组比较无显著差异，因此我们认为LNG-IUS可降低子宫内膜异位症的复发率，明显优于孕三烯酮，且可与GnRHa类药物媲美。TNF-α能诱导多种细胞产生MMP-9,还能促使MMP-9 由无活性的酶原向有活性的酶转化。LNG-IUS可显著下调在位内膜组织中TNF-a的表达，然而我们的研究却发现，LNG-IUS治疗后在位内膜组织中MMP-9的表达却显著升高，考虑与MMP-9被孕酮直接或间接刺激有关。Skinner JL[10]等研究表明：MMP-9活性存在于子宫内膜中，并且在腺体和基质细胞中呈现周期性的分布变化。应用LNG-IUS治疗的患者，在宫腔内局部高浓度孕激素的作用下，子宫内膜腺体和基质细胞以及脉管系统（内皮和血管周围细胞）中均高度表达MMP-9。故可推测，MMP-9可能通过LNG-IUS长期孕激素相关的形态学变化，在子宫内膜重塑和突破性出血的病因中发挥作用。
综上所述，LNG-IUS在降低EMs复发率方面疗效显著，不良反应小，对患者依从性并无严重影响，还可避孕，更推荐应用于已婚、且无生育要求的子宫内膜异位症保守性术后患者。
参考文献
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[2]Middleton LJ，Daniels JP，Weckesser A，etal.Preventing recurrence of endometriosis bymeans of long-acting progestogen therapy (PRE-EMPT): report of an internal pilot，multi-arm，randomizedcontrolled trial incurporating flexible entry design and adaption of design based on feasibility of recruitment[J].Trials.，2017Mar 11;18(1):121-130.
[3]Weir E，Mustard C，Cohen M，Kung R.Endometriosis: What is the risk of hospital admission，readmission，and major surgical intervention? [J].Journal ofMinimallyInvasive Gynecology，2005;12(6):486-493.
[4]中华医学会妇产科学分会子宫内膜异位症协作组.子宫内膜异位症的诊治指南[J]. 中华妇产科杂志，2015(3)：161-169.
[5]Paul S，Bhattacharya P，Das Mahapatra P，et al.Melatonin protects against endometriosis via
