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人体充质干细胞分离的生物学分析论文
人体充质干细胞分离的生物学分析论文 【摘要】目的比较人羊水源性及脐血源性的间充质干细胞(MSCs)分离、 培养及其生物学特性，为组织工程选取种子细胞提供实验依据。方法用贴壁分离 培养的方法分离两种来源的间充质干细胞，观察其形态与生长曲线，并用细胞化 学染色的方法测定其生物化学特性。结果两种来源的标本均可成功分离出MSCs， 但是孕中期羊水源性MSCs增殖能力要明显强于新生儿脐血源性的MSCs，二者有 相似的生物化学特性。结论孕中期羊水与新生儿脐血来源的MSCs是很好的组织 工程种子细胞,新生儿脐血来源的MSCs的增殖能力相对较弱，应用受到一定的限 制。【关键词】孕中期羊水;间充质干细胞;脐血 间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)具有多向分化潜能,是细胞治 疗及基因治疗的理想种子细胞。已有研究显示羊水[1]和脐血[2]可以分离出MSCs， 那么这两种来源的MSCs有哪些异同呢为此本研究将对孕中期人的羊水及新生儿 的脐血进行间充质干细胞的分离与培养，并对其基本生物学特性进行了比较研究， 为组织工程选取种子细胞提供基础性实验依据，现报告如下论文。
1材料与方法 1.1标本来源 羊水标本取自2008年3月至2010年3月吉林医药学院附属465医院妇产科， 妊娠在15～22周的引产羊水35份;32份脐带血标本取自正常足月剖腹产或足月正 常产乙肝病毒检测阴性的孕妇。取标本前均征得孕妇本人同意，研究获得吉林医 药学院附属465医院道德伦理委员会批准。
1.2主要试剂与仪器 PRMI1640(GIBCOBRL)，胎牛血清(GIBCOBRL)，马血清(GIBCOBRL)， 1.077×103g/LFicoll淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)，细胞化学染色试剂盒(BASO 公司)，CO2培养箱(FormaScientific公司)，荧光倒置显微镜(TE300,Nikon公司)。
1.3孕中期羊水MSCs的分离与培养羊水标本在室温下1500r/min离心5min， 弃上清，加入含10%胎牛血清(FBS)的PRMI1640培养液，制成密度为(1～5)×105 个/mL的单细胞悬液，接种到φ60mm塑料培养皿中，置饱和湿度、37℃、5%CO2培养箱中培养。第3天首次换液，去除非贴壁细胞，当类成纤维样细胞铺满平皿 达80%时，用0.25%的胰酶消化，用PRMI1640培养液制成浓度为4×104个/mL的细 胞悬液，接种到新培养皿中，记为第1代(P1)。每3d用含10%FBS的PRMI1640培 养液换液1次，细胞生长达到90%融合时按1∶4的比例传代。
1.4新生儿脐带血MSCs的分离与培养无菌条件下取正常足月剖腹产或足 月正常产乙肝病毒检测阴性孕妇的脐带血50～80mL，放于含CPDA1复合抗凝剂 的采血袋中，所有样本均在采集后12h内进行分离;将脐血用等量的DHank′s液稀 释制成细胞悬液,细胞悬液沿管壁缓慢加入到相对密度为1.077×103g/LFicoll人淋 巴细胞分离液上层,其比例为2∶1,注意液面清晰分层，以1500r/min进行梯度离心 20min，然后缓慢吸取中间交界面细胞悬液至另一离心管，获得含人MSCs的单个 核细胞悬液，加入含10%FBS的PRMI1640完全培养基,吹打并计数。以5×105个/mL 的密度接种到φ60mm培养皿中，48h首次换液,以后每3d换液。换液用含10%FBS 的PRMI1640完全培养基。在细胞80%左右融合时,用0.25%胰酶室温消化5min， 适量小牛血清终止消化反应，吸管轻轻吹打，转入离心管中1500r/min离心10min， 弃上清，按1∶3比例传代。
1.5MSCs的生长曲线测定将传至3、5、8代的MSCs制备成单细胞悬液，调 整细胞浓度为5×104/mL，接种于24孔培养板，每孔0.5mL;每天取3孔，消化后进 行细胞计数，共8d。以时间(d)为横坐标,细胞数为纵坐标，绘制生长曲线。
1.6MSCs的代谢情况检测传3代的羊水MSCs按5×104/mL密度接种于 φ35mm的培养皿中。2d后分别对培养皿中的细胞进行POX、SB、PAS、αNAE和 ALP细胞化学染色，显微镜观察、拍照。同样，新生儿脐血源性MSCs取第3代以 后细胞进行细胞化学染色分析。
2结果 2.1羊水MSCs 从羊水中分离出的细胞,将之接种于PRMI1640培养基中,2～3d部分细胞开 始贴壁,4～7d逐渐出现贴壁的MSCs,开始为圆形,逐渐伸出突起,呈成纤维样、梭形， 最初散在分布,后逐渐在局部形成集落生长(图1)。一周以后MSCs迅速扩增(图2), 约10d后可达80%～90%融合,扩增变缓,即可传代。传代后羊水MSCs5～6h即可贴 壁,2～4d生长迅速,1周后即可再次传代。形态为均一的成纤维样的MSCs，呈漩涡 样生长,即为羊水源性的MSCs(图3)。2.2新生儿脐血MSCs 脐血的单个核细胞悬液接种于φ60mm的塑料培养皿中，原代培养6d后， 在倒置显微镜下可见单个或少量呈集落生长的贴壁细胞，形态大多为椭圆形或短 梭形，凸出于培养皿表面。粘附于贴壁细胞之上的造血细胞和其他细胞在换液的 过程中逐渐被清除，10d后就形成细小纤维状小集落，20～25d后细胞集落不断地 扩大并形成融合超过80%，细胞形态大多呈短梭形。传代培养后的脐血MSCs12h 即可贴壁，4～14d生长迅速,10d后即可再次传代,细胞呈短梭形生长(图4，25×)。
10代左右细胞生长状态开始急剧衰退,细胞颗粒化严重，增殖速度严重放慢。
2.3MSCs的生长曲线 人羊水源性MSCs生长曲线呈“S”形，传代后第1、2天为潜伏适应期，从第 3天开始细胞增殖加速并进入对数生长期，第6至7天达到高峰，以后进入平台期。
通过对第3、5、8代新生儿脐血源性的MSCs细胞计数,绘制的生长曲线形状与羊 水源性MSCs生长曲线形状相似，呈S形(图5);传代第1至3天为生长停滞期，第4 对14天为快速增殖期，后即进入平台期。随传代次数增加,MSCs的增殖能力有所 减弱。第3、5代细胞增殖能力最强,第8代细胞较第3、5代细胞增殖能力减弱较明 显，但亦呈“S”形。
2.4不同源性MSCs的生物化学特征 羊水源性MSCs及脐血源性MSCs具有相同的生物化学特征，染色结果都显 示：POX、SB染色为阴性，αNAE、PAS为强阳性，ALP染色有1%为弱阳性，这 与文献报道的MSCs的染色特点相一致[34]。进一步证明了培养出的成纤维样细 胞为MSCs。图1.4d羊水贴壁细胞图2.7d羊水贴壁细胞图3.10d羊水贴壁细胞图 4.10d脐血贴壁细胞图5.羊水脐血MSCs生长曲线 3讨论 间质干细胞具有多向分化潜能，是细胞组织工程的首选种子细胞之一。然 而人骨髓中的MSCs含量较少，大约104～105个骨髓单个核细胞中只含有一个 MSCs[5],这显然难以满足细胞组织工程的实际需要，因此寻找MSCs的来源和如 何在体外分离扩增MSCs就显得较为重要。为了更好的得到MSCs，我们分别对孕 妇的羊水和新生儿脐带血进行了MSCs的分离，并对所得的MSCs生物学特性进行 了比较，以期得到更好的MSCs来源。间充质干细胞的分离,我们主要参考了Friedenstein建立的MSC分离方法并 做了适当的改进，利用MSCs的粘附性来获得MSCs。本实验将羊水细胞和脐血单 个核细胞接种于含10%胎牛血清PRMI1640培养基中，3d后去除未贴壁细胞，待 细胞单层长满80%后，用胰酶消化传代，本法可去除一些贴壁的非间质干细胞， 经过几次传代后即可得到相对较纯的MSCs。
本研究中采用孕妇的羊水和新生儿脐带血标本都可以成功地得到MSCs， 这与国外报道的相一致[6]，可作为未来组织工程学的一个不可或缺的来源[7]。
两者在形态和生物学特性上都非常类似，但是脐血源性的MSCs形态呈短梭形。
明显不同的就是人羊水源性MSCs增殖能力明显要优于脐血源性MSCs,这一点可 以从生长曲线与传代能力都得到较好体现。人羊水源性MSCs群体倍增时间较脐 血源性MSCs倍增时间短，且人羊水源性MSCs的传代能力明显强于脐血源性 MSCs。
综上所述，与脐血源性间充质干细胞增殖能力相比,羊水MSCs的获得更为 可观，是组织工程种子细胞的又一可靠来源。
