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摘要：目的：探讨TNF-a、TNFR和MMP-9在子宫内膜异位症（EMs）发病机制中的作用。方法：采用蛋白免疫印迹和实时聚合酶链反应检测20例EMs患者在位及异位内膜组织中、23例正常内膜组织中TNF-a、TNFR和MMP-9的表达。结果：TNF-a、TNFR和MMP-9在异位内膜和在位内膜中表达高于正常内膜，差异有显著性意义（P＜0.05），异位内膜表达高于在位内膜，差异具有显著意义（P＜0.05）。结论：TNF-a、TNFR和MMP-9在EMs组织中高表达，在EMs的发生发展中起着重要作用。
关键词：子宫内膜异位症；肿瘤坏死因子a；基质金属蛋白酶-9
中图分类号：R736.4文献标识码：A文章编号：1671-5837(2018)06-0060-02
子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)是育龄期女性的常见病、多发病，且近年来其发病率有上升趋势，但其发病机制至今仍不十分清楚。关于内异症发病机制的学说众多，继Sampson提出的经血逆流种植学说后，又提出了体腔上皮化生学说、诱导学说、胚胎残留学说，以及郎景和教授提出的“在位内膜决定论”等。近年来腹膜腔内环境在内异症发病中的作用备受关注，其中肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor α,TNF-α）作为炎症反应的细胞因子，在内膜异位症的黏附、侵袭、植入及增殖的过程中都发挥着非常重要的作用[1]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一组锌离子依赖的金属多肽酶超家族, 在正常组织中不表达或呈低表达，在多种恶性肿瘤中呈高表达，在基质降解、组织重塑、细胞迁移、血管生成、伤口愈合等病理生理过程中发挥关键作用，其表达水平与恶性肿瘤的浸润转移关系密切[2]。Paul等研究表明，MMPs一方面通过水解细胞外基质和基底膜的大量蛋白，为子宫内膜细胞的侵袭迁移提供条件，另一方面通过调控细胞凋亡过程，抑制子宫内膜细胞程序性凋亡反应，从而导致内膜细胞在盆腔等处异位生长[3]。本研究采用蛋白免疫印迹和实时聚合酶链反应检测TNF-α、TNFR和MMP-9在EMs患者异位内膜、在位内膜和正常子宫内膜中的表达，以了解其在EMs 发病机制中所起的作用，从而探讨EMs的发病机制。
1 材料与方法
1.1 材料
TNF-α（鼠源）抗体购于美国Abcam公司；TNFR（鼠源）、MMP-9（兔源）抗体购于美国Santa Cruz公司；β-actin（鼠源）抗体购自Sigma公司；β-actin 引物购自QIAGEN公司，编号QT00095431。TNF-α、MMP-9 的引物采用Primer 5软件进行设计。
1.2 方法
1.2.1 组织筛选
收集于2014年6月-2015年7月在保定市妇幼保健院因EMs住院行手术治疗的患者20例，年龄23～46岁，其中卵巢子宫内膜异位症15例，腹壁子宫内膜异位症5例，作为实验组;同时收集其在位内膜(取自术前诊刮标本或行子宫切除的手术标本)。对照组选择同期23例因子宫肌瘤行子宫肌瘤剔除术或子宫切除术的非子宫内膜异位患者，收集其子宫内膜组织作为对照，年龄25～50岁。两组患者月经规律，无其他内分泌、免疫和代谢性疾病，术前3个月未接受过激素治疗(包括避孕及流产药物)。所有标本均经病理确诊。
1.2.2 蛋白印记
（Western blot，WB）、反转录(RT)和实时荧光定量聚合酶链式反应PCR（qPCR）通过Western blot和real-time PCR的方法检测20例EMs患者在位及异位内膜组织中、23例正常内膜组织中TNF-a、TNFR和MMP-9的表达。
1.3 统计学处理
实验中所有数据均表示为mean±S.E。使用student-t检验方法分析实验结果，P<0.05被认为有显著性统计学差异。
2 结果
2.1 TNF-α表达情况
TNF-α蛋白、TNF-αmRNA表达一致，在异位内膜(Ec:ectopic endometrial)和在位内膜(Eu:eutopic endometrium)中表达高于正常内膜(Control)，差异有显著性意义（P＜0.05），异位内膜表达高于在位内膜，差异具有显著意义（P＜0.05）。（图1.1）。
图1.1 TNF-α在异位内膜和在位内膜中高表达
2.2 TNFR表达情况
TNFR蛋白在异位内膜和在位内膜中表达高于正常内膜，差异有显著性意义（P＜0.05），异位内膜表达高于在位内膜，差异具有显著意义（P＜0.05）。（图1.2）
2.3 MMP-9表达情况
MMP-9蛋白在异位内膜和在位内膜中表达高于正常内膜，差异有显著性意义（P＜0.05），异位内膜表达高于在位内膜，差异无显著意义（P>0.05）。（图1.3）
图1.2 TNF-α在异位内膜和在位内膜中高表达图1.3 MMP-9在异位内膜和在位内膜中高表达
3 讨论
EMs是一种雌激素依赖性炎性疾病，在绝经前女性中的发病率约为3%~15%[4]。有研究表明[5]，子宫内膜异位症患者腹膜液中高表达TNF-α，并且发现TNF-α表达水平与疾病的严重性呈正相关[6]。一些先前的研究表明子宫内膜异位症患者,特别是早期疾病患者血清TNF-α水平较高[7]。TNF发挥其生物学功能是通过与细胞表面相应的膜受体结合来实现的，TNF多聚体的每个亚基上的受体结合部位与受体(TNF-R)结合从而进行信号转导。由此可见TNF-R是TNF发挥生物学功能的基础，所以探讨TNF-R的表达差异对了解TNF的功能具有十分重要的意义[8]。
我们的研究显示TNF-α及TNFR在异位内膜和在位内膜中表达高于正常内膜，表明TNF-α通过TNFR在EMs的发病机制中发挥着重要的作用，因此阻断TNF-α是治疗EMs的重要靶点。阻断TNF-α可抑制动物中EMs疾病的发展，如D"Hooghe[9]等人对腹腔镜确认为EMs的狒狒进行试验，发现用p55可溶性TNF-α受体阻断TNF-α，可抑制子宫内膜植入物的发展和生长。但P.R.Koninckx[10]等人研究却发现英夫利昔单抗（单克隆抗体阻断TNF-α）作为对深部子宫内膜异位症的疼痛缺乏疗效，可能与深部子宫内膜异位症相关的严重疼痛与典型病变引起的不同，炎症可能在表面腹膜子宫内膜异位症中更重要，而在深部病变中神经侵袭或压迫更重要。
TNF-α作为促炎因子，能诱导细胞产生MMPs。MMPs除能降解ECM和BM(基底膜)外,还参与了血管的生长和内皮细胞的选择性扩张等活动, 与细胞的侵袭性生长机制密切相关。Stuelten[11]等发现TNF-α通过MMP-9的基因启动子上的多种核因子结合位点（如AP-1或NF-kB）上调MMP-9的表达。另外，TNF-α还能促使MMP-9由无活性的酶原向有活性的酶转化。多项研究表明TNF-α能诱导多种细胞产生MMP-9,参与多种疾病的发生，这种诱导作用主要是通过核转录因子-kappa B(nuclear factor kappa B,NF-kB)信号通路完成的[12]。我们的研究也显示MMM-9在异位内膜和在位内膜中表达高于正常内膜，表明MMP-9在EMs患者异位子宫内膜的过度表达可以促进逆流的子宫内膜组织碎片黏附到腹膜、卵巢表面,并降解ECM,导致病灶的形成，从而为临床治疗EMs提供新的诊治方法。
综上所述，推论联合检测TNF-α、TNFR、MMP-9可以作为评估疾病是否发生、进展情况以及治疗效果的评价指标，后续的实验结果将进一步证实上述推论。
参考文献
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[2]Polette M,Nawrocki-Raby B,Gilles C,et al.Tumor invasion and matrix met alloproteinases[J].Crit Rev Oncol Hemat,2004,49(3):179-186.
[3]Paul S,Bhattacharya P,Das Mahapatra P,et al.Melatonin protects against endometriosis via regulation of matrix metalloproteinase-3 and an apoptotic pathway[J].J Pineal Res,2010,49(2)：156-168.
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[10]P.R.Koninckx,M. Craessaerts,D.Timmerman,et al.Anti-TNF-a treatment for deep endometriosis-associated pain: a randomized placebo-controlled trial[J].Human Reproduction.2008,23(9)2017-2023.
[11]Stuelten CH,DaCosta Byfield S,Arany PR,eta1.Breast cancer cells induce stromal fibroblasts to express MMP-9 via secretion of TNF-alpha and TGF.beta[J].J Cell Sci,2005,18(10):2143-2153.
[12]Siddiqui F,Walters AS,Goldstein D,et a1.Half of patients with obstructive sleep apnea have a higher NREMAHI than REMAH I[J]Sleep Med,2006 Apr;7(3):281-285.
基金项目：保定市科技支撑计划项目（编号：16ZF045）
作者简介：王纪元，女，主治医师，1984年5月出生，硕士学位，从事妇产科临床工作，E-mail：[email protected]
